线粒体H+- ATP酶试剂盒

线粒体H+- ATP酶试剂盒

线粒体H+- ATP酶试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 线粒体 H+ - ATP 酶活性测定说明书 （货号：WS3680F 分光法 24 样） 一、产品简介： 线粒体是细胞呼吸代谢的重要场所，位于线粒体内膜的 H+ -ATP 酶是氧化磷酸化偶 联的关键组分。H+ -ATP 酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷，本试剂盒通过测定无 机磷的量来确定该酶活性高低。 二、试剂盒的组成和配制： 【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避 免磷污染。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液 器、研钵、冰和蒸馏水。 四、线粒体 H+ -ATP 酶活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免 实验样本和试剂浪费！ 1、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）： ① 称取约 0.2g 组织或收集 1000 万细菌/细胞，加入 1mL 提取液 1，用冰浴匀浆器或研 钵冰浴匀浆，转移至离心管后于 4℃×3000g 离心 20min。 ② 小心吸取上清液（弃沉淀）移至另一离心管中，4℃×16000g 离心 20min。用移液器 移除上清液（上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 H+- ATP 酶（此步可选做））。留下沉淀（沉淀即为线粒体）。 ③ 在沉淀（线粒体）中加入 200μL 提取液 2，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W， 超声 5s，间隔 3s，重复 30 次），液体置于冰上用于线粒体 H+ - ATP 酶活性测定。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取，或按照 细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 740nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 1 提取液 30mL×1 瓶 4℃保存 提取液 2 提取液 7mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 2mL 蒸馏水，混匀溶解备用。 试剂三 液体 3mL×1 支 4℃保存 试剂四 粉剂×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 1.8mL 蒸馏水，混匀溶解备用。 试剂五 粉剂×1 支 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 0.7mL 蒸馏水，混匀溶解备用。 试剂六 液体 5mL×1 瓶 4℃保存 试剂七 A:粉体 mg×1 瓶 B:液体 2mL×1 瓶 4℃保存 临用前加 1.8 mL 的 B 液，再加 23.2 mL 的蒸馏水，混匀溶解备用。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 在 EP 管中依次加入： ④ 显色反应，在 EP 管中依次加入： 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 1.7406x - 0.0035，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.0035)÷1.7406×V2] ÷（V1×Cpr）÷T =13.36×(△A+0.0035)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h/g 鲜重)= [(△A+0.0035)÷1.7406×V2]÷(W×V1÷V)÷T =13.36×(△A+0.0035)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 定义：每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.0035)÷1.7406×V2]÷(500×V1÷V)÷T =0.027×(△A+0.0035) 5、液体中酶活力计算: 定义：每小时每毫升液体分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 酶活力（μmol/h/mL）= [(△A+0.0035)÷1.7406×V2]÷V1÷T=13.36×(△A+0.0035) 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 210 225 试剂二 30 30 试剂三 45 45 试剂四 30 30 样本 60 60 混匀，静置 5min 试剂五 15 混匀，37℃孵育 20min 试剂六 75 75 混匀，12000rpm，4℃离心 5min，上清液待测 上清液 300 300 试剂七 450 450 混匀，室温静置 15min，740nm 下读取各管吸光值， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。本试剂盒仅供科研使用 3 V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.06mL ； V2---酶促反应总体积，0.465mL； T---反应时间，1/3 小时； W---样本鲜重，g； 500---细菌或细胞总数，500 万。 Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5μmol/mL）：标准品用 10mL 蒸馏水溶解。（母液需在两天内用）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。