果胶甲酯酶(PE)试剂盒

果胶甲酯酶(PE)试剂盒

果胶甲酯酶(PE)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 果胶酯酶（pectinesterase，PE）试剂盒说明书 （货号：WS7070D 48样） 一、产品简介： 果胶酯酶，属果胶酶系，亦称果胶甲酯酶、果胶氧化酶。催化水解果胶长链上的甲氧酯水解产生小分子 物质果胶酸和甲醇, 从而增加果胶在水中的溶解度。广泛存在于高等植物和可以降解细胞壁的细菌和真菌 中，起内源调控植物细胞壁上及细胞之间果胶含量的作用。 果胶酯酶（PE）催化水解果胶分子释放H+，使反应体系的pH下降，用碱液维持体系的pH始终保持在7.8(*酞指示剂维持在粉红色)，通过碱消耗的NaOH 量反映果胶酯酶的活性。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 80mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前加 12.5mL 蒸馏水于试剂瓶（50℃加热溶 解），冷却后转入 250mL 容量瓶，并定容至 250mL。 试剂二 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.5mL 乙醇溶 解备用。 试剂三 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 25mL×1 瓶 4℃保存 三、所需仪器和用品： 天平、研钵、离心机、水浴锅或恒温培养箱。 四、果胶酯酶（PE）的测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：取 0.5g 组织样品（叶片类样本可取 0.15g），加 1.5mL 提取液冰浴研磨， 12000rpm、4℃离心 15min，取全部上清液待测。 【注】：若酶活力太高，可降低样本取样质量W或将上清液稀释2-5倍后再进行测定，并在计算公式 中乘以稀释倍数D。 ② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或 细胞加入 1.5mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 试剂一于37℃烘箱保温10min。 ② 取出1mL的上清液转移至离心管或试管中。 ③ 向离心管或试管中依次加25μL 试剂二，4mL试剂一，混匀，并用试剂三调pH至7.8（粉 红色）。 ④ 将离心管或试管于37℃（水浴锅或恒温培养箱）孵育60min。每隔20分钟用试剂四调 节pH，使其维持在7.8（粉红色）。同时记录所消耗的试剂四的体积V2（mL）。 五、结果计算： 1、按照样本质量计算： 酶活定义：每克组织每小时消耗1μmol NaOH 定义为一个酶活单位U。 PE 活性(μmoL/min/g)=20×V2÷(V1÷V×W) ÷T×D =30×V2÷W×D 2、按照蛋白浓度计算：本试剂盒仅供科研使用 2 酶活定义：每毫克蛋白每小时消耗1μmol NaOH 定义为一个酶活单位U。 PE 活性(μmoL/min/mg prot)=20×V2÷(V1÷V×Cpr)÷T×D =30×V2÷Cpr×D 3、按细菌/细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每小时消耗 1μmol NaOH 定义为一个酶活单位 U。 PE 活性(μmoL/min/104 cell)=20×V2÷(V1÷V×500)÷T×D =0.06×V2×D V1---加入离心管或试管中的上清液体积，1mL； V---提取液体积，1.5mL； V2---滴定所消耗的试剂四的量，mL； T---反应时间，60 min=1h； D---样品稀释倍数； W---样品质量，g；20---试剂四的NaOH 浓度，20μmol/mL； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr----上清液蛋白质浓度（mg/mL），建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。