多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果胶酶试剂盒微板法

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果胶酶试剂盒微板法

多聚半乳糖醛酸酶(PG)/果胶酶试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 多聚半乳糖醛酸酶（ploygalacturonase，PG）试剂盒说明书 （货号：WS1070W 微板法 96 样） 一、产品简介： 果胶酶是指分解果胶的多种酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(PG),果胶裂解酶(PL),果胶 甲酯酶(PME)和原果胶酶，贮藏过程中起作用的主要是 PG。所以该酶在食品贮藏保鲜和 植物抗病性等领域具有较高的研究价值。 果胶在多聚半乳糖醛酸酶(PG)作用下，能水解产生带有具有还原性醛基的半乳糖醛酸。 与 DNS 试剂反应生成红棕色物质，在 540nm 有特征吸收峰，测定 540nm 处吸光值变化 可计算得多聚半乳糖醛酸酶活性。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、天平、可调式移液器、恒温水浴锅、研钵、冰。 四、多聚半乳糖醛酸酶(PG)的测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 1mL 经预冷的 95%乙醇冰浴匀 浆，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀，向沉淀中加入经预 冷的 80%乙醇混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀。再 向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液，涡旋混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 10min；留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 20 20 试剂一 130 试剂二 130 40℃水浴 30min本试剂盒仅供科研使用 2 【注】若△A 在零附近徘徊，可增加样本上样量 V1（如增加至 50μL，则试剂一或二相应减少）， 或延长反应时间 T（如增至 1h），则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 18.053x - 0.0263：x 为标准品质量，mg；y 为△A。 2、按照蛋白浓度计算： 酶活定义：在 40℃，每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位。 PG 活性(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1×Cpr)÷T=5.54×(ΔA+0.0263)÷Cpr 3、按照样本质量计算： 酶活定义：在 40℃，每克样本每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U）。 PG 活性(mg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1÷V×W)÷T=5.54×(ΔA+0.0263)÷W 4、按细菌/细胞密度计算： 酶活定义：在 40℃，每 1 万个细菌或细胞每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶 活力单位（U）。 PG 活性(mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷(V1÷V×500)÷T=0.011×(ΔA+0.0263) 5、按液体体积计算： 酶活定义：在 40℃，每毫升液体每小时分解果胶酸产生 1mg 半乳糖醛酸为一个酶活力单位 PG 活性(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0263)÷18.053]÷V1÷T=5.54×(ΔA+0.0263) V---加入提取液体积，1mL； V1---反应中样本体积，0.02mL； W---样本质量，g； T---反应时间，0.5h; 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液(10mg/mL)：向标准品 EP 管里面加入 1mL 的蒸馏水（母液需在两 天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成五个浓度梯度的标准品：0，1，2，3，4，5.mg/mL。也可根据实际样 本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。 试剂三 150 150 沸水浴（95-100℃）5min，冰浴或淋浴冷却后，取 200μL 于 96 孔板中，540nm 处测定吸光值 A，△A=A 测定管-A 对照管（每个测定管设一个对照管）。