葡萄糖氧化酶（GOD）活性测定试剂盒,微板法

葡萄糖氧化酶（GOD）活性测定试剂盒,微板法

葡萄糖氧化酶（GOD）活性测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 葡萄糖氧化酶（GOD）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS1950W 微板法 96 样） 一、产品简介： 葡萄糖氧化酶（GOD，EC 1.1.3.4）是一种常见于多种微生物中的氧化还原酶，葡萄糖 氧化酶催化葡萄糖和氧反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和特异显色剂反应产生 （粉）红色产物，该产物在510nm有吸收峰，进而得到葡萄糖氧化酶酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉体 mg×2 支 4℃保存 用前甩几下使粉体落入底部，每支 加 1.2mL 的蒸馏水溶解备用。 标准管 液体 mL×1 支 4℃保存 三、所需仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、天平、移液器、研钵、离心机、蒸馏水。 四、葡萄糖氧化酶（GOD）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 0.1g 组织样本（水分充足的样本建议取 0.2g 左右），加 1mL 的蒸馏水研磨，粗提液 全部转移到 EP 管中，12000rpm，4℃离心 10min，上清液待测。 ② 细胞/细菌样本： 先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细胞/细菌加入 1mL 蒸馏水或 PBS 或生理盐水，超声波破碎细胞/细菌（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： 1 酶标仪预热 30min，设定波长到 510nm。 2 所有室温至室温（25℃）。在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 试剂一 60 试剂二 100 样本 20 混匀，37℃孵育 5min 试剂三 20 混匀，于 510nm 下读取吸光值 A1，37℃孵育 20min 后读取吸光值 A2，△A =A2-A1。 【注】：若△A 值在零附近，则增加样本加样体积 V1（如增至 50μL，则试剂一相应减少）， 或延长反应时间 T（如延长至 40min 或 60min），则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。本试剂盒仅供科研使用 2 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 11.151x - 0.0212：x 为 H2O2标准品(μmoL)，y 为ΔA。 2、按样本鲜重计算： 单位定义：在 37℃，每克组织每小时生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位（U）。 GOD (μmoL/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0212)÷11.151]÷(W×V1÷V)÷T =13.45×(ΔA+0.0212)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：在 37℃，每毫克组织蛋白每小时生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位（U）。 GOD (μmoL/h/mg prot)=[(ΔA+0.0212)÷11.151]÷(V1×Cpr) ÷T=13.45×(ΔA+0.0212)÷Cpr 4、按细胞/细菌数量计算： 单位定义：在 37℃，每 104个细胞/细菌每小时生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位（U）。 GOD (μmoL/h/104 cell)=[(ΔA+0.0212)÷11.151]÷(500×V1÷V)÷T=0.027×(△A+0.0212) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02mL； T---反应时间，20min=1/3h； W---样本质量，g； 500---细胞数量，万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（250μmol/mL）。 2 把母液稀释成以下浓度：0，0.5，1，1.5，2，2.5μmol/mL。也可根据实际调整浓度。 3 在 96 孔板中直接加入：20μL 标准品+80μL 试剂一+100μL 试剂二，混匀于 510nm 处 读值，依据结果即可制作标准曲线。