糖化酶/葡萄糖淀fen酶试剂盒,微板法

糖化酶/葡萄糖淀fen酶试剂盒,微板法

糖化酶/葡萄糖淀fen酶试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 糖化酶(Glucoamylase)试剂盒说明书 （货号：WS9650W 微板法 48 样） 一、产品简介： 糖化酶，又称葡萄糖*粉酶（EC 3.2.1.3），是一种外切型糖苷酶，它从淀粉的非还原性 末端水解α-1,4 糖苷键和α-1,6 糖苷键，将淀粉*全水解为葡萄糖，因此广泛的应用于酒精、 白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。 糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物，在 540nm 处有光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比，可测定计算得糖化 酶的活力。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前用提取液于 80℃水浴溶 解，并定容至 10mL。 试剂二 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰。 四、糖化酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细胞样本： 先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入 1mL 提取液；超声波破 碎细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm 离心 10min，取上清作为待测样品。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 所有试剂解冻至室温； ③ 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 10本试剂盒仅供科研使用 2 煮沸样本 10 试剂一 100 100 充分混匀，40℃反应 20min 试剂二 200 200 混匀，沸水浴（95-100℃）5min，流水冷却后，取出 200μL 至 96 孔板中，于 540nm 处读取吸光值 A，△A=A 测定-A 对照（每个样本自身需做一个自身对照）。 【注】：1. 若ΔA 过小，可以延长 40℃反应时间 T（如：40min 或更长），或增加样本量 V1（如增至 20μL，则试剂二相应减小），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 2. 若 A 值大于 1.5，可缩减 40℃反应时间 T（如：10min 或更短），或减少样本量 V1（如减 至 5μL，则试剂二相应增加），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y=0.0239x-0.0515，x 是标准品质量（μg），y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 定义：每毫克组织蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生 1μg 葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。 糖化酶活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0515) ÷0.0239]÷ (V1×Cpr) ÷T=209.21×(ΔA+0.0515)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生 1μg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。 糖化酶活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0515) ÷0.0239]÷(W×V1÷V) ÷T=209.21×(ΔA+0.0515)÷W 4、按细胞数量计算： 定义：每 104个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生 1μg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。 糖化酶活性(nmol /min /104 cell)=[(ΔA+0.0515) ÷0.0239]÷(500×V1÷V)÷T=0.419×(△A+0.0515) 5、按照液体体积计算： 定义：每毫升液体每分钟分解可溶性淀粉产生 1μg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。 糖化酶活性(nmol /min /104 cell)=[(ΔA+0.0515) ÷0.0239]÷V1÷T=209.21×(ΔA+0.0515) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01mL； W---样本质量，g； T---反应时间，20min； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 1, 2, 3, 4, 5 mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 依据测定管加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。