NAD+-山li醇脱氢酶(NAD+-SDH)试剂盒微板法

NAD+-山li醇脱氢酶(NAD+-SDH)试剂盒微板法

NAD+-山li醇脱氢酶(NAD+-SDH)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 NAD+ -山*醇脱氢酶活性测定试剂盒说明书 （货号：WS9550W 微板法 96 样） 一、产品简介： 山*醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）催化山*醇脱氢生成果糖，是调控 生物体内山*醇含量的关健酶之一，依据依赖的辅酶分为 NAD+依懒性山*醇脱氢酶 （NAD+ -SDH，EC 1.1.1.14）和 NADP+依懒性山*醇脱氢酶（NADP+ -SDH）， NAD+ -SDH 催化山*醇转化成果糖，NADP+ -SDH 催化山*醇转化成葡萄糖。 NAD+ -SDH 催化山*醇脱氢生成果糖，同时还原 NAD+生成 NADH，测定 340nm 吸光度增加速率可以计算 NAD+ -SDH 酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部， 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部， 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、NAD+ -山*醇脱氢酶（NAD+ -SDH）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织（水分充足样本可取 0.5g 组织），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注意】 若样本颜色较深（如植物叶片），可引起起始值 A1 值较大如超过 1.6，可在样本制备过程中 增加除色素步骤：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 80%乙醇冰浴匀浆，12000rpm， 4℃离心 10min，弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的沉淀中加入 1mL 提取液，混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm 离心 10min，取上清作为待测样品。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 3 液体样本：澄清的液体样本直接检测；若浑浊离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，设置温度 25℃,调节波长至 340nm。 ② 所有试剂放在 30℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂一 10 试剂二 160 混匀，25℃下孵育 10min 试剂三 10 混匀，25℃下，20s 时于 340nm 处读取 A1， 20min 后读取 A2。ΔA=A2-A1。 【注】： 若ΔA 过小，可以延长反应时间（如：40min 或更长）再读取 A2，或加大样本体积 V1 （如增至 40μL，则试剂二相应减少），重新调整的反应时间 T 和加样体积 V1 需代入 计算公式重新计算。 五、结果计算： 1. 按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD+ -SDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.8×ΔA÷Cpr 2. 按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD+ -SDH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W×V1÷V) ÷T=160.8×ΔA÷W 3. 按细菌或细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD+ -SDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.32×ΔA 4. 按照液体体积计算 酶活定义：每毫升液体每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 NAD+ -SDH（nmol/min/mL）= [ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T=160.8×ΔA ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02 mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； T---反应时间，20 min； 500---细菌或细胞总数，500 万； W---样本质量； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。