海藻糖酶(Trehalase)试剂盒,微板法

海藻糖酶(Trehalase)试剂盒,微板法

海藻糖酶(Trehalase)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 海藻糖酶（Trehalase，THL）试剂盒说明书 （货号：WS4550W 微板法 48 样） 一、产品简介： 海藻糖酶（EC 3.2.1.28）广泛存在于细菌、霉菌和动植物中。能够专一性的水解海藻糖 生成葡萄糖而直接用于能量供应。 海藻糖酶催化海藻糖生成葡萄糖，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下与特异显色剂反应 生成有色物质，通过检测该有色物质的生成量，即可得出海藻糖酶的活性大小。 二、测试盒组成和配制： 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、低温离心机、可调式移液器、研钵、冰。 四、海藻糖酶(THL)活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）至研钵中，加入 1mL 提取液，进行冰 浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌或真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30 次）；4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取 ③ 液体样本：澄清的液体样本，可直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 510nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 煮沸样本：上清液（样本）在 95-100℃煮沸 5min 即可，然后离心，上清液备用。 ④ 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 100 100（煮沸样本） 试剂一 200 200 试剂二 50 50 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再 加入 6mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再 加入 2.1mL 蒸馏水溶解备用。 试剂四 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。本试剂盒仅供科研使用 2 30℃反应 1 小时后，8000rpm 离心 10 分钟，取上清液待测。 ⑤ 显色反应，在 96 孔板中依次加入： 上清液 50 50 试剂三 20 20 试剂四 130 130 40℃反应 20min，于 510nm 处读取吸光值 A， △A=A 测定-A 对照。 【注】1.若测定管 A 值大于 1.5，可以对样本用蒸馏水进行稀释（尤其是含糖量高的果实类样本）， 或者对⑤步的上清液用蒸馏水进行稀释，则稀释倍数 D 代入计算公式计算。 2.若△A 差值在零附近，可增加④步中样本的体积 V1（如增至 200μL，则试剂一相应减少）， 则改变后的 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 0.106x + 0.0011；x 为标准品质量（μg），y 为△A。 2、按照蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白在每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL (μg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0011)÷0.106×(0.35÷0.05)]÷(V1×Cpr)÷T=660.4×(ΔA-0.0011)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL (μg/h/g 鲜重)=[(ΔA-0.0011)÷0.106×(0.35÷0.05)]÷(W×V1÷V)÷T=660.4×(ΔA-0.0011)÷W 4、按细菌或真菌密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或真菌每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL (μg/h/104cell)=[(ΔA-0.0011)÷0.106×(0.35÷0.05)]÷(500×V1÷V)÷T=1.321×(ΔA-0.0011) 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL (μg/h/mL)= [(ΔA-0.0011)÷0.106×(0.35÷0.05)]÷V1÷T=660.4×(ΔA-0.0011) V--提取液体积，1 mL；V1--样本体积：0.1mL；W--样本质量，g；T--反应时间，1 小时； 500--细菌或真菌数量，500 万；0.35--第④歩反应的总体积；0.05--第⑤歩反应上清液体积； Cpr--样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：从标准品管中称量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸馏水混匀溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度：0, 0.04,0.08,0.12,0.16, 0.2mg/mL。 3 于第⑤歩显色反应阶段：50μL 标准品+20μL 试剂三+130μL 试剂四，40℃反应 20min， 于 510nm 处读取吸光值 A，依据结果即可制作标准曲线。