多糖含量测定试剂盒（ben酚-硫酸法）

多糖含量测定试剂盒（ben酚-硫酸法）

多糖含量测定试剂盒（ben酚-硫酸法）

本试剂盒仅供科研使用 1 多糖含量试剂盒说明书 (货号：WS3950F 分光法 48 样） 一、产品简介： 糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与*酚缩合成橙 黄色化合物，且颜色稳定，在波长 488 nm 处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量 呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的 多糖含量，本方法可用于多糖含量的测定 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 粉剂×3 支 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部， 每支分别加 1.9mL 水溶解备用。 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅/金属浴、可调式移液器、乙 醇、浓硫酸（不允许快递）、研钵。 四、多糖含量的测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1 多糖待检液制备： a.组织样本： ① 样本烘干研磨过 40 目筛，称取 3mg 过筛后细末至 2mLEP 管中，加入 2mL 蒸馏水， 于沸水浴（95-100℃）加热 2 小时（若放在金属浴上面可用重物压盖防止 EP 管崩 开；间隔 20min 带防护手套轻轻晃动混匀几下），加热结束后取出放置至室温， 8000rpm 离心 5min， ② 取 0.2mL 上步离心后的上清液至新 EP 管中，再加入 1mL 乙醇混匀，于 4℃放置 1 小时，取出后 8000rpm 离心 5min 后弃上清，留沉淀； ③ 上步所得沉淀中再加入 1mL80%乙醇混匀几下（自备：取 80mL 乙醇溶于 20mL 蒸 馏水中），8000rpm 离心 5min 后弃上清，留沉淀（可采用使 EP 管轻轻倒置于吸 水纸上约 5min 吸干剩余上清液，尽量避免沉淀损失）； ④ 向上步所得沉淀中加入 2mL 蒸馏水，于沸水浴（95-100℃）加热直到沉淀全部溶 解（约 5min）即多糖待检液。 b.液体样本： ① 取 0.2mL 液体(可先做两个样本预测定，确定适合本批液体样本取样量 V2)，至新 EP 管中，再加入 1mL 乙醇混匀（使乙醇在整个液体中占比至少 80%），于 4℃放 置 1 小时，取出后 8000rpm 离心 5min 后弃上清，留沉淀； ②上步所得沉淀中再加入 1mL80%乙醇混匀几下（自备：取 80mL 乙醇溶于 20mL 蒸 馏水中），8000rpm 离心 5min 后弃上清，留沉淀（可采用使 EP 管轻轻倒置于吸 水纸上约 5min 吸干剩余上清液，尽量避免沉淀损失）； ③ 向上步所得沉淀中加入 2mL 蒸馏水，于沸水浴（95-100℃）加热直到沉淀全部溶 解（约 5min）即多糖待检液。 2、上机检测：本试剂盒仅供科研使用 2 ① 可见分光光度计预热 30min，调节波长至 488nm，调节水浴锅或金属浴至 95-100℃。 ② 向标准品中加入 1mL 蒸馏水即 1mg/mL 葡萄糖母液，用蒸馏水稀释 20 倍（1 份母液:19 份水）成 0.05mg/mL 葡萄糖，用于测定。在 EP 管中依次加入： 试剂（μL） 测定管 空白管（仅做一次） 多糖待检液 200 标准品 蒸馏水 200 试剂一 100 100 浓硫酸(务必缓慢加入) 500 500 混匀放入 95℃水浴 20min（封口膜缠紧，防止水分散失），冷 却至室温后，取全部澄清液体转移至 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中，于 488nm 读取吸光值 A，ΔA=A 测定管-A 空白管。 【注】:1. 如果ΔA 大于 1.5，需要将样本用蒸馏水稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数 D。 2. 若ΔA 值在零附近即低于 0.005，则可增加样本取样质量 W，则改变后的 W 需代 入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准方程为 y = 56.157x - 0.0036；x 为标准品质量（mg），y 为吸光值ΔA。 2、按样本重量计算： 多糖(mg /g 重量)=[(ΔA+0.0036)÷56.157]÷(W×V1÷V)×10×D =1.781×(ΔA+0.0036)÷W×D 3、按质量分数（%）计算： 多糖(%重量)=[(ΔA+0.0036)÷56.157]÷(W×V1÷V)×10×D×10-3×100% =[0.1781×(ΔA+0.0036)÷W×D]% 4、按液体体积计算： 多糖(mg /mL 液体)=[(ΔA-0.0065)÷86.454]÷(V2×V1÷V)×10×D =2.313×(ΔA-0.0065)÷V2×D V---样品提取液总体积，2mL； V1---测定时待检液体积，0.2mL； V2---液体取样体积，mL； 10---②歩中取 0.2mL 处理后变成 2mL 体积； W---样本质量，g； D---自行稀释倍数，未稀释即为 1W---样本质量，g； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：从标准品管中称量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸馏水混匀溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05. mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。