支链氨基酸转氨酶(BCAT)活性测定试剂盒

支链氨基酸转氨酶(BCAT)活性测定试剂盒

支链氨基酸转氨酶(BCAT)活性测定试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 支链氨基酸转氨酶(Branched-chain amino acid aminotransferase，BCAT) 试剂盒说明书 (货号：WS3440F 分光法 24 样) 一、产品简介： 支链氨基酸转氨酶(BCAT, E.C.2.6.1.42) 属于以磷酸吡哆醛作为辅酶的Ⅳ类转氨酶。该酶分布十分广 泛，已经发现广泛存在于原核生物和大多数真核生物中。 支链氨基酸转氨酶(BCAT)催化特异 L-型氨基酸氨基转移到α-酮戊二酸，形成相应的支链α-酮酸和谷*酸；再用特异作用于谷*酸的酶复合体分解谷*酸，同时与显色剂反应生成黄色物质，该物质在 450nm 处 有吸收峰，进而得到支链氨基酸转氨酶(BCAT)的酶活性大小。 该酶催化反应：L-leucine + 2-oxoglutarate = 4-methyl-2-oxopentanoate + L-glutamate。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 55mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 再加 2.2mL 的蒸馏水充分溶解，仍 4℃保存。 试剂二 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 再加 1.2mL 蒸馏水溶解备用。仍 4℃保存。 试剂三 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。仍 4℃保存。 试剂四 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 4mL×1 支 4℃保存 试剂六 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试管底部， 再加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。仍-20℃保存。 试剂七 液体 1mL×1 支 4℃保存 标准品 液体 mL×1 支 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、可调式移液器、研钵和蒸馏水。 四、支链氨基酸转氨酶(BCAT)活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分多的样本取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴 匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】:若增加样本量，可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞 加入 1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】:若增加样本量，按照细菌/细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 40 40本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 40 试剂三 20 20 试剂四 200 240 样本 150 150 混匀，37℃反应 60min（准确时间），立即于 95℃沸水中水浴 2min 后，上下振动几下混匀后，12000rpm 室温离心 5 分钟，上清液待测。 ③ 显色反应：在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 提取液 370 370 试剂五 80 80 试剂六 20 20 试剂七 20 20 上清液 210 210 混匀，30℃反应 15min，液体全部转移至 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm） 中，立即于 450nm 处读取吸光值 A，△A=A 测定-A 对照（每个样本 需设一个自身对照）。 【注】若△A 差值在零附近徘徊，可以在显色反应阶段增加上清液（V3）的量（如增加到 300μL，则 提取液相应减少），则改变后的 V3 重新代入公式计算；或延长第②歩中 30℃反应时间 T（如 由 60min 增加至 90min），则改变后的反应时间 T 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 0.0446x + 0.008； x 为谷氨*摩尔质量（nmol），y 为△A。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每小时生成 1 nmol 的谷氨*定义为一个酶活力单位。 BCAT (nmol/h/mg prot)=[(ΔA-0.008)÷0.0446]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T=320.3×(ΔA-0.008)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每小时生成 1 nmol 的谷*酸定义为一个酶活力单位。 BCAT (nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA-0.008)÷0.0446]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T=320.3×(ΔA-0.008)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 单位定义：每百万细菌或细胞每小时生成 1 nmol 的谷*酸定义为一个酶活力单位。 BCAT(nmol/h/104 cell)=[(ΔA-0.008)÷0.0446]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T=0.64×(ΔA-0.008) V--提取液体积，1 mL；V1--加入样本体积，0.15mL；V2--反应总体积，0.45mL； V3--显色阶段上清液体积，0.21mL；T--反应时间，60min=1h；W--样本质量，g； 500---细胞数量，百万； Cpr--样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司 BCA 蛋白含量测定试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（10nmol/μL）。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1. nmol/μL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段，测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。