谷草天冬氨酸氨基转氨酶GOTAST试剂盒微板法

谷草天冬氨酸氨基转氨酶GOTAST试剂盒微板法

谷草天冬氨酸氨基转氨酶GOTAST试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)试剂盒说明书 （货号：WS4240W 微板法 96 样） 一、产品简介： 天冬氨酸氨基转移酶，俗称谷草转氨酶，缩写为 AST 或 GOT（EC 2.6.1.1）广泛存在 于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化可逆转氨基反应，是氨基酸代谢的重要酶。 谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)催化天门*氨酸和α-同戊二酸发生转氨基 反应，生成谷*酸和草酰乙酸，草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙酮酸；丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯肼反应生成 2,4-二硝基*腙，在碱性溶液中显棕红色；通过在 520nm 读取吸光 值并计算出该酶活力大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 4mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 4mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 40mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、研钵。 四、谷草转氨酶/天冬氨酸氨基转氨酶(GOT/AST)活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例提取。 ③ 血清（浆）样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机测定： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 520nm。 ② 可先做 2 个样本预测定，熟悉操作过程，并依据测出的吸光值 A 是否超出标准曲线的 线性范围来做调整。 3 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 10 试剂一 20 20 混匀，于 37℃孵育 30min 试剂二 20 20 样本 10本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，于 37℃孵育 10min 试剂三 200 200 混匀，25℃孵育 10min，于 520nm 处测定吸光值 A， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。 【注】1.若 A 测定超过 1.2，可降低样本量 V1（如 5μL，另外 5μL 用蒸馏水补齐，总体积 10μL 保持 不变）。则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 2.若△A 的值在零附近徘徊，则可增加样本量 V1（如 15μL，则试剂一相应减少），或增加样本 取样质量（W），则改变后的加样体积 V1 和取样质量 W 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.4941x + 0.0039，x 为标准品浓度（μmol/mL）；y 是ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GOT/AST(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =67.5×(ΔA-0.0039)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GOT/AST(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(W×V1÷V)÷T×103 =67.5×(ΔA-0.0039)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GOT/AST(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1]÷(500×V1÷V)÷T×103 =0.135×(ΔA-0.0039) 5、血清（浆）GPT 活力计算： 酶活定义：每毫升血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 GOT/AST(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0039)÷0.4941×V1] ÷V1÷T×103=67.5×(ΔA-0.0039) V---提取液体积，1 mL； V1---反应体系中样本体积，0.01mL； T---反应时间，30 min； W---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL ；建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（20μmol/mL）：加 1mL 蒸馏水溶解标准品，充分混匀。 2 把母液稀释成以下浓度：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。 3 10μL 标准品+20μL 试剂一+20μL 试剂二，混匀，于 37℃孵育 10min ；再加 200μL 试剂三，混匀，25℃孵育 10min，于 520nm 处测定吸光值 A，依据结果即可制作标 准曲线。