土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)试剂盒,微板法

土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)试剂盒,微板法

土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤酸性蛋白酶（Solid -Acid Protease，S-ACPT）试剂盒说明书 （货号：WS6130W 微板法 48 样） 一、产品简介： 蛋白酶是广泛存在于土壤中的一大酶类，它能水解各种蛋白质以及肽类等化合物为氨基酸，因此土壤蛋 白酶的活性与土壤中氮素的转化状况有极其重要的关系。 土壤酸性蛋白酶（S-ACPT）在酸性条件下将酪蛋白水解产生酪*酸；酪*酸与福林酚在碱性条件下反应 生成蓝色化合物；该蓝色物质在 680nm 有特征吸收峰，进而得 S-NPT 酶活，由于底物酪蛋白自身含有多种 氨基酸，所以在检测过程中必须设置带有底物酪蛋白的对照，以扣除有干扰的背景值，排除假阳性。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格试剂名称 保存要求 备注 试剂一 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，每瓶加入 3mL 试 剂 三 90℃ 加 热 搅 拌 至 分 散 （ 约 10-20min），再加 12mL 试剂一搅拌至溶解， 最后再加试剂一定容至 30mL,继续搅拌至 全部溶解（约 30min）；配置完的试剂 4℃保 存，三天内用完。 试剂三 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 用前摇匀 试剂四 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 用前摇匀 试剂五 液体 35mL×1 瓶 4℃保存 用前摇匀 试剂六 液体 8mL×1 棕色瓶 4℃保存 现用现配，临用前加 16mL 蒸馏水， 4℃保存，一星期内用完 标准品 粉体 mg×1 支 EP 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 【注】:试剂二若在磁力搅拌器（带温控）上溶解，可用锡箔纸或保鲜膜盖住烧杯，以免溶解过程中水分 蒸发过快。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、蒸馏水 四、土壤酸性蛋白酶（S-ACPT）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 取新鲜土样或者 37 度烘箱风干（需先粗研磨），过 40 目筛网备用。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 680nm。 ② 配制好的试剂二需预先 50℃水浴 10min。 ③ 在 EP 管中依次加入下列试剂培养： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 土样（g） 0.15g 鲜土 或 0.1g 干土 0.15g 鲜土 或 0.1g 干土 试剂一 500 500 试剂二 500 50℃振荡培养 2h，同时，余下的试剂二须单独 50℃振荡培养 2h 上歩单独 50℃培养过的试剂二 500本试剂盒仅供科研使用 2 试剂四 500 500 混匀，立即 1700rpm（须准确），4℃离心 10min，上清液待用 ④ 显色反应：在 EP 管中依次加入： 上清液 200 200 试剂五 300 300 试剂六 200 200 室温静置 20min（若仍浑浊，可以延长静置时间至 30min 或 1700rpm 离心 10min），取 200μL 于 96 孔板中，于 680nm 读取吸光值 A， △A=A 测定管-A 对照管（每个样本做一个对照管）。 【注】：若△A 的值在零附近徘徊，可以加样土样取样量（如两倍的土壤质量）。 五、结果计算： 1、标曲线准方程：y = 0.0154x + 0.0015，x 是标准品浓度（μg/mL），y 是ΔA。 2、单位定义：每小时每克鲜土中产生 1μg 酪*酸为一个酶活力单位。 土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)(μg/h/g 鲜土)=(ΔA-0.0015)÷0.0154×V1÷W1÷T =48.8×(ΔA-0.0015) ÷W1 3、单位定义：每小时每克干土中产生 1μg 酪*酸为一个酶活力单位。 同等质量的鲜土（参与实际反应的鲜土质量）在 105℃烘干，即得相应的干土质量。 土壤酸性蛋白酶(S-ACPT)(μg/h/g 干土)= (ΔA-0.0015)÷0.0154×V1÷W2÷T =48.8×(ΔA-0.0015) ÷W2 V1---培养步骤中总的反应体积，1500μL =1.5mL； T---反应时间，2h； W1---样本质量，以实际称取鲜土质量为准； W2---相对应的干土质量。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（100μg/mL）：标准品溶解于 100mL 的 0.1mol/L 的盐酸溶液中（母 液需在两天内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 4, 8, 12, 16, 20. μg/mL。也可根据实际样本 来调整标准品浓度。 3 依据测定管的显色反应阶段加样表依次加样，根据结果即可制作标准曲线。