外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶(CBH)微板法

外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶(CBH)微板法

外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶(CBH)微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶（S-CBH）活性测定试剂盒说明书 (货号：WS3230W 微板法 96 样) 一、产品简介： 土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶又称土壤纤维二糖水解酶（CBH，EC 3.2.1.91）是土壤纤维素 酶系的组份之一，该酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖（还原糖）分子，本 试剂盒采用该酶催化对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷生成黄色物质对-硝基*酚（PNP），该物 质在 405nm 有特征光吸收，进而得到土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶（S-CBH）活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 120mL×1 瓶 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×4 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部， 每支再加入 1.4mL 蒸馏水溶解， 4 度保存。 试剂三 液体 40mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅或恒温振荡培养箱、可调式移液器、蒸馏水。 四、土壤外切-β-1,4-葡聚糖酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 取新鲜土样或干土（风干或者 37 度烘箱风干），先粗研磨，过 40 目筛网备用。 【注】：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻； 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 空白管（仅做一次） 土样（g） 0.1 0.1 试剂一 750 800 750 试剂二 50 50 充分混匀，37℃培养 2 小时（振荡培养或间隔 20min 手动振荡 混匀几下） 试剂三 200 200 200 混匀，8000rpm 离心 5min（若上清液不澄清可加大离心力），取 200μL 上清液至 96 孔板中，405nm 下读取吸光值 A，△A=A 测 定- A 对照-A 空白（每个样本做一个自身对照）。 【注】：1.若ΔA 较小，可延长 37℃的孵育时间 T（如增至 4 小时或更长），或增加土样质 量 W（如增至 0.3g）。则改变后的 T 和 W 需代入计算公式重新计算。 2.若测定管 A 值大于 1.5 或△A 大于 1.5，可缩短 37℃的孵育时间 T（如减至 0.5 小时或更短）， 或减少土样质量 W（如减至 0.05g）。则改变后 T 和 W 需代入计算公式重新计算。或对最本试剂盒仅供科研使用 2 后一步的待检测上清液（包括测定管、对照管和空白管）同时用蒸馏水进行稀释，稀释倍 数 D 代入计算公式。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0108x + 0.0053；x 为标准品摩尔质量（nmol），y 为△A。 2、单位定义：每小时每克土样中产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义为一个酶活单位。 S-CBH 活力(nmol/h/g 土样)=(ΔA-0.0053) ÷0.0108÷W÷T×D =46.3×(ΔA-0.0053)÷W×D T---反应时间，2h； W---土壤样本实际取样量，g； PNP 相对分子质量---139.11。 D---稀释倍数，未稀释即为 1。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸馏水超声溶解。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/mL。也可根据实际样本 来调整标准品浓度。 3 在 EP 管加入：50μL 标准品+750μL 试剂一+200μL 试剂三，混匀，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下读取吸光值，根据结果制作标准曲线。