土壤中性磷酸酶(S-NP)试剂盒,微板法

土壤中性磷酸酶(S-NP)试剂盒,微板法

土壤中性磷酸酶(S-NP)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤中性磷酸酶（S-NP）试剂盒说明书 (货号：WS6030W 微板法 96 样) 一、产品简介： 土壤磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用，是评价土壤磷素生物转化方向和强度的 指标，也与土壤碳、氮含量、有效磷含量和 pH 有一定的关系。 本试剂盒提供一种简单、灵敏、快速的检测方法。在中性环境中，土壤中性磷酸酶（S-NP） 催化磷酸对硝基苯酯（pNPP）生成黄色的产物 PNP，该产物在 405nm 处有吸收峰。 通过检测 PNP 在 405nm 下的增加速率，即可得到土壤中性磷酸酶活性的大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 每瓶临用前加 10mL 试剂一充分溶解， 一周内用完。 试剂三 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、恒温培养箱、天平、可调式移液器、蒸馏水、甲苯。 四、土壤中性磷酸酶（S-NP）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 取新鲜土样或干土（风干或者 37 度烘箱风干），先粗研磨，过 40 目筛网备用。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 405 nm。 ② 在离心管中依次加入下列试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 空白管 （只做一次） 土样 0.1g 鲜土或 0.05g 干土 0.1g 鲜土或 0.05g 干土 甲苯 10 10 10 试剂一 290 490 290 试剂二 200 200 混匀， 37℃（水浴锅或恒温培养箱）振荡反应 1h 试剂三 300 300 300 混匀，12000rpm 室温离心 10min，取 200μL 上清液转移至 96 孔 板中，于 405nm 下读取各管吸光值 A，△A=A 测定-A 对照-A 空 白（每个测定管需设一个对照管）。 【注】：1.最后一步检测时，若有结晶析出，需要 37℃复溶再读取吸光值。 2.若ΔA 在零附近徘徊，可延长 37℃的孵育时间 T（如增至 4 小时或更长），或增加 土样质量 W（如增至 0.2g）。则改变后的 T 和 W 需代入计算公式重新计算。 3.若测定管 A 值大于 1.5 或△A 大于 1.5，可缩短 37℃的孵育时间 T（如减至 0.5 小时或更短）。本试剂盒仅供科研使用 2 则改变后 T 需代入计算公式重新计算。或对最后一步的待检测上清液（包括测定管、对照管 和空白管）同时用蒸馏水进行稀释，稀释倍数 D 代入计算公式。 4.若同时检测一大批同一背景下土壤样本（如都是黄土，黑土，红土，黄土等），可做三次样 本自身对照管（取平均值作为这批土壤样本的对照管），可从称样到检测步骤节省检测时间。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0139x + 0.0005；x 是 PNP 摩尔质量（nmol），y 是△A。 2、定义：每克土壤每小时水解 PNPP 产生 1nmol 对硝基*酚（PNP）为一个酶活单位。 S-NP(nmol/h/g 土样)=[(△A-0.0005)÷0.0139]÷W÷T×D=71.9×(△A-0.0005)÷W×D W---土壤样品质量，g； D---稀释倍数，未稀释即为 1； T---催化反应时间，1h； PNP 相对分子质量---139.11。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmoL/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸馏水超声溶解， 若有结晶析出，需 37℃水浴至*全溶解。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 1.6, 3.2, 4.8, 6.4, 8 μmoL/mL。也 可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 在 EP 管中直接加入：10μL 标准品+490μL 试剂一+300μL 试剂三，混匀，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下读取吸光值。 4 根据结果制作标准曲线。