谷an酰胺酶(GLS)试剂盒

谷an酰胺酶(GLS)试剂盒

谷an酰胺酶(GLS)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 谷*酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒说明书 (货号：WS7040F 分光法 48 样) 一、产品简介： 谷*酰胺酶（GLS，EC 3.5.1.2）是酰胺酶的一种，催化谷*酰胺水解成谷*和氨， 在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。 谷*酰胺酶（GLS）催化谷*酰胺水解成 L-谷*酸和氨，利用氨在强碱的环境下与次 氯酸盐和*酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液颜色稳定。其在 630nm 处有特征吸收 峰，通过检测氨增加的速率，即可计算该酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，每瓶再加 11mL 蒸馏水溶解备用。 试剂三 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 24mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂六 A：液体 7mL×4 瓶 B：液体μL×1 支 4℃保存 临用前取 60μL 的 B 液进一瓶 A 液中，混匀后 作为试剂六使用。混匀后的试剂六一周内用完。 标准管 液体 mL×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该标曲。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、台式离心机、可调式移液枪、研钵。 四、谷*酰胺酶（GLS）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分足的样本可取 0.2-0.5g），加入 1mL 提取液；进行 冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s， 重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 630nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 EP 管依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 80 80 试剂一 200 200 试剂二 200 试剂三 200 混匀，放入 37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育 1h本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 200 试剂三 200 混匀，室温 12000rpm 离心 10min，上清液待测。 ③ 显色反应：在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 上清液（上步反应） 60 60 蒸馏水 180 180 试剂四 240 240 试剂五 120 120 试剂六 240 240 充分混匀，37℃放置 20min 后，全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿 （光径 1cm）中，于 630nm 处读取吸光值 A， ΔA=A 测定管-A 对照管（每个样本做一个自身对照）。 【注】1. 试剂四和五和六需分开加，不能事先混匀。 2. 若ΔA 的值较小，可增加 37℃孵育时间（如增至 2 小时或更长），或在显色阶段增加上清液量 V1(如增至 120μL，则蒸馏水体积相应减少)；则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 3. 若 A 测定大于 1.8，可减少 37℃孵育时间（如减至 0.5 小时或更短），或在显色阶段减少上清 液量 V1(如减至 30μL，则蒸馏水体积相应增加)；则改变后的 T 和 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 1.2921x - 0.0071；x 为标准品质量（μg），y 为吸光值ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克蛋白质每小时催化谷*酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 GLS(μg/h/mg prot)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T=110×(ΔA+0.0071)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每小时催化谷*酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 GLS(μg/h/g 鲜重)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T=110×(ΔA+0.0071)÷W 4、按细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞每小时催化谷*酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 GLS(μg/h/104 cell)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T=0.22×(ΔA+0.0071) 5、按照液体体积计算： 单位定义：每毫升液体每小时催化谷*酰胺生成 1μg 氨定义为一个酶活力单位。 GLS(μg/h/mL)=(ΔA+0.0071)÷1.2921×(V2÷V3)÷V1÷T=110×(ΔA+0.0071) V---提取液体积，1mL； V1----加入②歩反应体系中样本体积，0.08mL； V2---②歩反应体系总体积：0.68mL； V3---③歩显色步骤中上清液体积，0.06mL； T---反应时间，1h； W---样本质量； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（10μg/mL 的氨），把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL。 2 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。