谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)试剂盒,微板法

谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)试剂盒,微板法

谷an酸合成酶(NADH-GOGAT)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 NADH-谷*酸合成酶（Glutamate synthase, NADH-GOGAT）试剂盒说明书 （货号：WS3040W 微板法 96 样） 一、产品简介： 谷*酸合成酶（GOGAT)广泛分布于植物中，植物吸收的无机氮经硝酸还原糖（NR）和亚硝酸还原酶 （NIR）还原成 NH4+后，通过谷氨*胺合成酶（GOGAT）参与的 GS/GOGAT 途径才能进行氮素的同化和 利用。GOGAT 一般包含两类：一类是多存在于叶绿体（叶片）中的 Fd-GOGAT，另一类是多存在于非绿 色组织（根）前质体中的 NADH-GOGAT。 NADH-谷*酸合成酶（NADH-GOGAT，EC 1.4.1.14) 催化谷*酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两 分子的谷*酸；同时 NADH 氧化生成 NAD+，可以通过检测 340nm 吸光度的下降速率得出 NADH-GOGAT 的酶活性大小。 该酶催化的反应：L-glutamine + 2-oxoglutarate + NADH + H+=2 L-glutamate + NAD+ 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×2 支 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试 管底部，每支再用 2.2mL 的提取液充 分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保 存，禁止反复冻融，三天内用完。 试剂二 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 用前甩几下或 4℃离心使试剂落入试 管底部，每个试剂瓶再用 7mL 的提取 液充分溶解，仍 4℃保存。 【注】：粉剂量在 mg 级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、NADH-GOGAT 酶活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、粗酶液提取： 称取约 0.1g 组织（水分多的样本取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取，若样本 颜色较深（如植物叶片），可引起起始值 A1 值较大如超过 1.5，可在样本制备过程中增加除色素步 骤：取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 80%乙醇冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min， 弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的沉淀中加入 1mL 提取液， 混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 2、测定步骤： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 ② 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 40 试剂二 140 混匀，340nm 下进行时长扫描，1min 时读取 A1，10min 后读取 A2 值，本试剂盒仅供科研使用 2 ΔA=A1-A2。 【注】1.若 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以 适当减少样本加样量 V1（如减至 10μL，另外 10μL 用提取液补齐），则改变后的 V1 需代入计 算公式重新计算。或者减少试剂一的加样量（如减至 20μL，另外 20μL 用蒸馏水补齐） 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于检测； 2. 若ΔA 的值大于 0.4，则需减少反应时间（如减少至 5min），则改变后的反应时间 T 需代入计 算公式重新计算。 3. 若下降趋势不稳定，可以每隔 20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算， 相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GOGAT（nmol Glu/min/mg prot）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T =6430.9×ΔA÷Cpr ÷T 2、按样本鲜重计算： 单位的定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 NADH-GOGAT（nmol Glu /min/g 鲜重）=2×[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V) ÷T =6430.9×ΔA÷W÷T V--提取液体积，1 mL； V1--加入样本体积，0.02 mL； V2--反应总体积，2×10-4 L； d--96 孔板光径，0.5cm； ε--NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； T--反应时间，本实验中是 10min，若线性区间的时间改变则以实际检测时间代入公式计算； Cpr--样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司 BCA 蛋白含量测定试剂盒； 2----每合成 2nmol 的 Glu 有 1nmol 的 NADH 被氧化； W--样本质量，g；