土壤焦磷酸酶(S-PPase)试剂盒,微板法

土壤焦磷酸酶(S-PPase)试剂盒,微板法

土壤焦磷酸酶(S-PPase)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤焦磷酸酶活性测定试剂盒说明书 (货号：WS9330W 微板法 96 样) 一、产品简介： 土壤焦磷酸酶（焦磷酸盐磷酸水解酶，EC 3.6.1.1）催化焦磷酸盐水解成正磷酸盐。在 土壤有机磷的矿化和转化中发挥重要作用。 本试剂盒提供一种简单、灵敏、快速的的检测方法。土壤焦磷酸酶催化焦磷酸盐水解 成磷酸盐。可通过在 700nm 处测定生成的无机磷量来确定该酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿， 避免磷污染。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、蒸馏水。 四、土壤焦磷酸酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 取新鲜土样或者 37 度烘箱风干（需先粗研磨），过 40 目筛网备用。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min，调节波长到 700 nm。 ② 反应 mix 制备：试剂四和五按照要求加蒸馏水溶解后，按试剂三：四：五=10:2:5 的比例依次混合配置（需现配现用，若出现蓝色则需弃掉重新配置）。 ③ 在离心管中依次加入下列试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 土壤样本（g） 0.1 0.1 试剂一 370 370 试剂二 30 混匀，37℃振荡培养 2h（间隔 30min 振荡混匀一次） 试剂三 200 200 试剂二 30 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 80mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再 加 6.4mL 蒸馏水，混匀溶解备用。 试剂三 液体 65mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用甩几下使试剂落入底部，再 加 4.2mL 蒸馏水，混匀溶解备用。 试剂五 粉体 mg×7 支 4℃保存 临用甩几下使试剂落入底部，每 支再加 1.5mL 蒸馏水，混匀溶解 备用，现配现用。 标准品 粉体 1 mL×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂本试剂盒仅供科研使用 2 立即混匀，于 12000rpm，室温或 4℃离心 5min，上 清液需立即测定，不可久置。 ④ 显色反应，在 96 孔板中依次加入： 上清液 50 50 反应 mix 150 150 混匀，室温静置 15min，于 700nm 处读取吸光值 A， △A=A 测定-A 对照（参看注意事项）。 【注】：1. 若△A 的值在零附近，可延长孵育时间 T（如增至 5h）。 2. 若是同时检测同一背景下的土壤样本（如同一批样本不同时间点的取样）， 此批土壤样本可做一个批次的样本自身对照，节省时间。 五、结果计算： 1、标准曲线：y=0.5987x - 0.0003；x 是标准品摩尔浓度（μmol/mL）， y 是△A。 2、活性定义：在 37℃，每克土壤每小时水解 1μmol 焦磷酸产生 1μmol 无机磷定义为 1 个 酶活单位。 土壤焦磷酸酶(μmol/h/g 土样)=(△A+0.0003)÷0.5987×V1÷W÷T =0.5×(△A+0.0003)÷W V1---孵育阶段整个反应体积：600μL=0.6mL； W---土壤样品质量，g； T---催化反应时间，2 h； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5μmoL/mL）：标准品用 10mL 蒸馏水溶解。（母液需在两天内用）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0，0.2，0.4，0.6，0.8，1. μmol/mL。也可根 据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。