土壤芳基酰胺酶活性测定试剂盒

土壤芳基酰胺酶活性测定试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤芳基酰胺酶活性测定试剂盒说明书 （货号：WS4430F 分光法 24 样） 一、产品简介： 土壤芳基酰胺酶（Aryl-acylamidase，EC 3.5.1.13）可水解带有酰胺基团的化合物；本 试剂盒利用土壤芳基酰胺酶水解底物 L-亮*酸β-萘胺生成β-萘胺，β-萘胺接着与对二甲 氨基肉桂醛生成红色偶氮化合物，该化合物于 540nm 处有特征吸收峰，通过检测该红色 物质的增加速率，即可计算土壤芳基酰胺酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 试剂一 液体 20mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再 加入 6mL 蒸馏水，充分溶解备用， 试剂三 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再 加入 15mL 乙醇，充分溶解备用。 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、天平、离心机、恒温水浴锅、乙醇、 可调式移液器。 四、土壤芳基酰胺酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样本情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 取新鲜土样风干或者 30℃烘箱风干，先粗研磨，过 40 目筛，备用。 【注】：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻； 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 0.1g 土壤 0.1g 土壤 试剂一 300 300 试剂二 100 混匀，于 37℃孵育 2h（间隔 30min 振荡混匀一次） 95%乙醇 600 600 试剂二 100 立即混匀，于 12000rpm，室温或 4℃离心 10min，离心 10min， 上清液待测。本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应，在 EP 管中依次加入： 上清液 280 280 试剂三 280 280 试剂四 280 280 混匀，10min 后，全部液体转移至 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中，于 540nm 处测定吸光值 A， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。 【注】：1.若△A 值在零附近徘徊，可在 37℃孵育阶段延长反应时间 T(如增至 3h 或更长)，或增 加土壤样本量 W（如增至 0.2g），则改变后的反应时间 T 和 W 需代入公式重新计算。 2. 若 A 测定的值大于 1.8，可用乙醇对整个红色显色反应液进行稀释，则稀释倍数 D 需代入公式参与计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0546x - 0.016，x 是标准品浓度（μg/mL）, y 是△A。 2、酶活定义：37℃条件下，每克土样每小时释放出 1μg 的β-萘胺为一个酶活力单位。 土壤芳基酰胺酶活性(μg/h/g 土样)=(△A+0.016)÷0.0546×V1÷W÷T =9.2×(△A+0.016)÷W V1---孵育阶段的反应总体积，1mL； T---反应时间，2h； W---样本质量，g； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（2.5mg/mL）：标准品用 1mL 乙醇溶解。（母液需在两天内用）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 5, 10, 15, 20, 25. μg/mL。也可根 据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。