土壤植酸酶(S-Phytase)试剂盒,微板法

土壤植酸酶(S-Phytase)试剂盒,微板法

土壤植酸酶(S-Phytase)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 土壤植酸酶（phytase）试剂盒说明书 （货号：WS7330W 微板法 48 样） 一、产品简介： 植酸酶（phytase，EC.3.1.3.8）是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶 的总称，属磷酸单酯水解酶，能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效 磷，降低粪便中的磷含量，减轻对环境的污染，改善营养成分的吸收和利用，因此具有极 其广泛的研究和应用价值。 土壤植酸酶在一定温度和 pH 值条件下，水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物，无 机磷在酸性环境中与钼酸铵反应生成蓝色复合物，通过在 700nm 处检测该有色物质的生 成速率即可计算植酸酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格试剂名称 保存要求 备注 试剂一 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再 加入 28mL 试剂一，充分溶解备 用， 试剂三 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再 加入 16mL 蒸馏水，充分溶解备 用。 试剂五 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使试剂落入底部，再 加入 4mL 蒸馏水，充分溶解备用。 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 反应 mix 的制备（现配现用）：试剂四：五按照 4:1 的比例混合，可根据样本数量配制需要量， 若一次性用完，可把试剂五一次性全部倒入试剂四中，混合备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、天平、低温离心机、恒温水浴锅，可调式移液器。 四、土壤植酸酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样本情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 取新鲜土样风干或者 30℃烘箱风干，先粗研磨，过 40 目筛备用。 【注】：土壤风干，减少土壤中水分对于实验的干扰；土壤过筛，保证取样的均匀细腻； 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 700nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 土壤 0.1g 0.1g 试剂一 500 试剂二 500 混匀，37℃振荡培养 1 小时本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 100 100 混匀，室温条件下 10000rpm，离心 5min。上清液待测。 ③ 显色反应，在 EP 管中依次加入： 上清液 100 100 试剂三 50 50 反应 mix 150 150 混匀，室温（25℃）静置 15min，于 700nm 处读取吸光 值A，△A=A测定-A对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】1. 若显色反应阶段静置后出现浑浊现象，静置结束后可先于室温 10000rpm，离心 5min 后， 再取全部上清液至 96 孔板中， 2. 若△A 值在零附近徘徊，可在 37℃孵育阶段延长反应时间 T(如增至 3h 或更长)，或增加 土壤样本量 W（如增至 0.2g），则改变后的反应时间 T 和 W 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.4881x + 0.0009，x 是标准品摩尔浓度（μmoL/mL）, y 是△A。 2、酶活定义：37℃条件下，pH5.5 的条件下，每克土样每小时释放出 1μmol 的无机磷为 一个酶活力单位。 土壤植酸酶活性(μmol/h/g 土样)=(△A-0.0009)÷0.4881×V1÷W÷T =1.23×(△A-0.0009)÷W V1---孵育阶段的反应总体积，0.6mL； T---反应时间，1h； W---样本质量，g； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5μmoL/mL）：标准品用 10mL 试剂一溶解。（母液需在两天内用）。 2 把母液用试剂一稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.6, 1.2, 1.8, 2.4, 3. μmoL/mL。也 可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。