总蛋白酶活性试剂盒,微板法

总蛋白酶活性试剂盒,微板法

总蛋白酶活性试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 总蛋白酶试剂盒说明书 (货号：WS3121W 微板法 48 样) 一、产品简介： 蛋白酶活力通常利用天然底物和合成底物进行测定。各种蛋白酶均可水解天然底物 酪蛋白因此由酪蛋白测得的活力是蛋白酶的总活力。 本试剂盒利用总蛋白酶催化水解偶氮酪蛋白，生成的产物于 366nm 有光吸收，通 过测定吸光值的变化得出总蛋白酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存条件 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部， 再加13mL的蒸馏水混匀备用。 试剂二 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 36mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、天平、研钵、冰和蒸馏水。 四、总蛋白酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心 10min， 取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 366nm。 ② 所有试剂解冻至室温或于 25℃水浴锅中孵育 20min。 ③ 在 EP 管中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 120 120 试剂一 120 试剂二 120 120 混匀，30℃孵育 60min 试剂三 360 360 试剂一 120 立即混匀，低温（放冰上）静置 5min；室温 12000rpm 离心 5min，直接取 200μL 至 96 孔板中，于 366nm 处读 值。ΔA=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。 【注】：若ΔA 在零附近徘徊，可以延长 30℃孵育时间 T（如延长至 90min）或增加样本取样 质量 W（如增至 0.2g），则改变后的反应时间 T 和 W 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本鲜重计算： 定义：每克组织每小时反应体系中变化 1 个吸收单位定义为 1 个偶氮酪蛋白单位。 总蛋白酶(偶氮酪蛋白单位/h/g 鲜重)=ΔA÷1÷(W×V1÷V)÷T=8.3×ΔA÷W 2、按样本蛋白浓度计算： 定义：每毫克组织蛋白每小时反应体系中变化 1 个吸收单位定义为 1 个偶氮酪蛋白单位。 总蛋白酶(偶氮酪蛋白单位/h/mg prot)=ΔA÷1÷(V1×Cpr)÷T=8.3×ΔA÷Cpr 3、按细菌/细胞数量计算： 定义：每 104个细菌/细胞每小时反应体系中变化 1 个吸收单位为 1 个偶氮酪蛋白单位。 总蛋白酶(偶氮酪蛋白单位/h/104 cell)=ΔA÷1÷(500×V1÷V)÷T=0.02×ΔA÷Cpr 4、按照液体体积计算： 定义：每毫升液体每小时反应体系中变化 1 个吸收单位定义为 1 个偶氮酪蛋白单位。 总蛋白酶(偶氮酪蛋白单位/h/mL)=ΔA÷1÷V1÷T=8.3×ΔA V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.12mL； W---样本质量，g； T---反应时间，60min=1h； 500---细胞数量，万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。