胰蛋bai酶试剂盒-可见显色法

胰蛋bai酶试剂盒-可见显色法

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本试剂盒仅供科研使用 1 胰*白酶（Trypsin）试剂盒说明书 (货号：WS9021F 分光法 48 样) 一、产品简介： 胰*白酶(EC 3.4.4.4) 是蛋白酶的一种，可以催化水解酰胺键。是一种重要的消化酶。 胰*白酶催化水解 N-苯甲酰-DL-精*酸-对硝基苯胺盐酸盐(BAPNA)生成对硝基苯胺，后者 在 405nm 有吸收峰，通过测定吸光值升高速率即可得出胰*白酶的活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存条件 备注 试剂一 液体 50mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 1.2mL×1 支 -20℃保存 若凝固则可于 37℃水浴至融化。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、台式离心机、可调式移液器、天平、研钵、 冰和蒸馏水。 四、胰*白酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本 和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 生理盐水，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心 10min，取上清， 置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加 入 1mL 生理盐水，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min， 取上清液检测。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至至 37℃或 37℃水浴 15-30min。 ③ 反应 mix 制备：试剂二若凝固则可于 37℃水浴至融化，再按照试剂一：试剂二=0.97mL： 0.03mL 混匀成反应 mix，现配现用，用多少量配制多少反应 mix。 ④ 在 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（μL） 测定管 样本 120 反应 mix 680 混匀， 立即于 405nm 处测定吸光值 A1，37℃ 条件下反应 10min 后读取 A2，ΔA=A2-A1。 【注】：若ΔA 在零附近徘徊，可以延长反应时间 T（如延长至 20min 后读取 A2）或增加样本量 V1 （如增至 150μL，则反应 mix 相应减少），则改变后的 T 和样本量 V1 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.008x - 0.0067：x 为标准品(nmoL)，y 为ΔA。 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0067)÷0.008]÷(W×V1÷V)÷T =104.2×(ΔA+0.0067)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。 胰*白酶(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0067)÷0.008]÷(V1×Cpr)÷T=104.2×(ΔA+0.0067)÷Cpr 4、按细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。 胰蛋*酶(nmoL/min/104 cell)= [(ΔA+0.0067)÷0.008]÷(500×V1÷V)÷T=0.21×(ΔA+0.0067) 5、按照液体体积计算： 单位定义：每毫升液体每分钟催化产生 1nmoL 对硝基苯胺定义为一个酶活单位（U）。 胰蛋*酶(nmoL/min/mL)= [(ΔA+0.0067)÷0.008]÷V1÷T=104.2×(ΔA+0.0067) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.12 mL； W---样本质量，g； 500--细菌或细胞总数，500 万； T---反应时间，10min； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/mL）：临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入 0.1mL 乙 醇，涡旋震荡溶解后再加入 0.9mL 的蒸馏水混匀，得到 10μmol/mL 备用。 2 用蒸馏水把母液稀释成以下浓度：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。 3 120μL 标准品+680μL 试剂一，混匀后于 405nm 处读取 A 值，依据结果即可制作标准曲线。