鸟an酸转氨酶(OAT)试剂盒,微板法

鸟an酸转氨酶(OAT)试剂盒,微板法

鸟an酸转氨酶(OAT)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 鸟*酸转氨酶（OAT）测定试剂盒说明书 （货号：WS7011W 微板法 96 样） 一、产品简介： 鸟*酸转氨酶（OAT，EC 2.6.1.13）是以鸟*酸为前体合成脯*酸的关键酶, 对植物 适应逆境胁迫起关键作用 鸟*酸转氨酶（OAT）在底物鸟*酸和α-酮戊二酸存在下，使鸟*酸脱氨并伴随着 NADH 的氧化，通过检测 NADH 在 340nm 处吸光值的下降量，即可计算得出鸟*酸转 氨酶的酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、鸟*酸转氨酶（OAT）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清检测。 2、 上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 ② 所有试剂解冻至室温。 ③ 在 96 孔板依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 20 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×3 支 4℃保存 临用前甩几下，使粉体落到底部， 再加入 0.5mL 蒸馏水溶解备用，用 不完的试剂分装后-20℃保存，禁 反复冻融，三天内用完。 试剂二 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下，使粉体落到底部， 再加入 5mL 蒸馏水溶解备用 试剂三 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下，使粉体落到底部， 再加入 5mL 蒸馏水溶解备用本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 130 室温（25℃）放置 5min 试剂四 20 混匀，立即于 340nm 处检测，10s 时读取 A1，15min 后读取 A2，△A= A1-A2。 【注】1.若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间到 30min 后或更长读取 A2，改变后的反应时 间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量，则改变后的加样体积需代入计算公式 重新计算。 2. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏 高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于检测； 3. 若下降趋势不稳定，可以每隔 20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与 计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 OAT 活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T =214.4×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 OAT 活力（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W×V1÷V)÷T =214.4×ΔA÷W 3、按细菌/细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位（U）。 OAT 活力(nmoL/min/104 cell)= [ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.43×ΔA 4、液体中 OAT 活力的计算: 单位定义：每毫升液体每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 OAT 活力（nmol/min/mL）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T =214.4×ΔA V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞数量； T---反应时间，15min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。