γ-氨基丁酸(GABA)含量试剂盒,微板法

γ-氨基丁酸(GABA)含量试剂盒,微板法

γ-氨基丁酸(GABA)含量试剂盒,微板法

1 γ-氨基丁酸（GABA）含量试剂盒说明书 （货号：WS6011W 微板法 96 样） 一、产品简介： 4-氨基丁酸（GABA）广泛分布在动植物体中。在动物体内 GABA 几乎只存在于神经 组织中。在植物中如豆属、参属、中草药等的种子、根茎和组织液中都含有 G A B A， 且与植物的环境应激反应有关。 4-氨基丁酸（GABA）在碱性溶液中与次氯酸盐和*酚反应生成蓝绿色物质，通过检 测该有色物质在 645nm 波长处的值，即可得出样本中 GABA 的含量。 二、试剂盒的组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 4mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 2mL×1 支 4℃保存 临用前取出0.13mL试剂二至一支 新 EP 管中，再向其中加入 1.87mL 蒸馏水混匀做为试剂二使用（该 液体一周内用完）。 试剂三 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液枪、水浴锅、离心机、研钵、蒸馏水。 四、γ-氨基丁酸（GABA）含量测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织样本加入研钵中，加入 1mL 提取液，在冰上进行匀浆， 12000rpm，4℃或室温离心 10min，取上清液待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s， 重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：澄清的液体样本直接测定，若浑浊则离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min，调节波长到 645 nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。则试剂一和二可按照 30:200 的比例预先配制成混合液 （用多少配多少，现配现用），在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 空白管（仅做一次） 样本 50 蒸馏水 50 混合液 230 230 试剂三 100 100 混匀，沸水浴（95-100℃）10min，冰浴至室温，若浑浊需2 12000rpm 离心 5min，取澄清的 200μL 至 96 孔板中，于 645nm 处读取各管的 A 值。△A=A 测定-A 空白。 【注】1.若测定管的 A 值大于 1，则需将样本进行稀释（用蒸馏水稀释），稀释倍数 D 需代入计 算公式重新计算。 2.若△A 值低于 0.01，则可增加样本取样量 W（如增至 0.2g）或增加样本加样量 V1（如 由 50μL 增至 100μL，则混合液和试剂三均各自减少 25μL），则 W 和 V1 代入计算公式重 新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0576x - 0.0236，x 为标准品质量(μg)，y 为吸光值ΔA。 2、按样本质量计算： GABA 含量(μg/g 重量)=[(ΔA+0.0236)÷0.0576]÷(W×V1÷V)×D =347.2×(ΔA+0.0236)÷W×D 3、按细胞数量计算： GABA 含量(μg/104 cell)=[(ΔA+0.0236)÷0.0576]÷(500×V1÷V)×D =0.7×(ΔA+0.0236)×D 4、液体中 GABA 含量计算： GABA 含量(μg/mL)=[(ΔA+0.0236)÷0.0576]÷V1×D=347.2×(ΔA+0.0236)×D V---提取液体积，1mL； V1---样本加入体积，0.05mL； D---稀释倍数，未稀释即为 1； W---样本取样质量，g； 500---细胞数量，万。 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（5mg/mL）：标准品临用前甩几下使粉体落入底部，再加 2mL 蒸馏水溶解（两天内用 完）。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL。也可根据实际样本 来调整标准品浓度。 3 按照测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。