GABA转氨酶(GABA-T)试剂盒,微板法

GABA转氨酶(GABA-T)试剂盒,微板法

GABA转氨酶(GABA-T)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）测定试剂盒说明书 （货号：WS3011W 微板法 48 样） 一、产品简介： γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T，EC 2.6.1.96)是 GABA 支路中的关键酶之一，催化 GABA 的降解和转化。 本试剂盒利用γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）催化丙酮酸和 GABA 反应生成生成琥 珀酸半醛和丙*酸，通过检测 GABA 的减少量进而得出 GABA-T 酶活力大小。 反应方程式：4-aminobutanoate + pyruvate = succinate semialdehyde + L-alanine 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部， 再加 3mL 试剂三溶解备用。 试剂二 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部， 再加 4.5mL 试剂三溶解备用。 试剂三 液体 8mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 11mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 试剂六 A：液体 8mL×3 瓶 B：液体 2mL×1 支 4℃保存 临用前取0.55mL的B液进一瓶A 液中，混匀后作为试剂六使用。 混匀后的试剂六半个月内用完。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样本情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、 样本制备： 取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 2、 上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 645nm。 ② 所有试剂解冻至室温，在 EP 管依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 40 蒸馏水 40 试剂二 40 40 混匀，于 30℃孵育 30min 试剂四 80 80 立即混匀，室温 12000rpm，离心 5min，上清液待测本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应：于 EP 管中依次加入： 上清液 50 50 试剂四 30 30 试剂五 100 100 试剂六 200 200 混匀，沸水浴（95-100℃）10min，冰浴至室温，呈现蓝绿色颜 色，若浑浊需 12000rpm 离心 5min，取澄清的 200μL 至 96 孔板 中，于 645nm 处读取各管的 A 值，△A=A 对照-A 测定(每个样本 需做一个自身对照)。 【注】若ΔA 值在零附近，可增加样本质量 W（如增至 0.2g），或延长 30℃孵育时间 T（如增至 1h 或更长），或加大样本量 V1（如增至 80μL，则试剂四相应减少），则改变后的 W 和 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.508x - 0.0003，x 为标准品质量(mg/mL)，y 为吸光值ΔA。 2、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每小时消耗 1mg 的 GABA 定义为一个酶活力单位。 GABA-T (mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(V1×Cpr)÷T=19.7×(ΔA+0.0003)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每小时消耗 1mg 的 GABA 定义为一个酶活力单位。 GABA-T (mg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(W×V1÷V)÷T =19.7×(ΔA+0.0003)÷W 4、按细菌/细胞数量计算： 单位定义：每 104个细胞每小时消耗 1mg 的 GABA 定义为一个酶活单位。 GABA-T (mg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷(500×V1÷V)÷T =0.04×(ΔA+0.0003) 5、按照液体体积计算: 单位定义：每毫升液体每小时消耗 1mg 的 GABA 定义为一个酶活力单位。 GABA-T(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0003)÷0.508]×V2÷V1÷T=19.7×(ΔA+0.0003) V---提取液体积，1mL； V1---加入反应体系中样本体积，0.04mL； V2---反应体系总体积：0.2mL； T---反应时间，30min=0.5h； W---样本质量，g； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（2mg/ml）：标准品临用前加 1mL 蒸馏水溶解。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml。也可根据实 际样本来调整标准品浓度。 3 按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。