脯an氨酸脱氢酶(ProDH)试剂盒

脯an氨酸脱氢酶(ProDH)试剂盒

脯an氨酸脱氢酶(ProDH)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 脯*酸脱氢酶（PDH）试剂盒说明书 （货号：WS1011F 紫外法 48 样） 一、产品简介： 脯*酸脱氢酶(proline dehydragenase，PDH，EC 1.5.1.2) 催化脯*酸生成 Δ1-二氢吡咯- 5-羧酸的反应，是脯*酸降解过程的限速步骤。脯*酸是分布*广泛的一种渗透物质，在胁 迫条件下很多植物可以通过增加合成、减少降解而在体内累积大量脯*酸，降低 PDH 活性 对于防止渗透胁迫对植物造成伤害、保护细胞结构等方面具有重要意义。 脯*酸脱氢酶(PDH)催化脯*酸脱氢并使 NAD+还原成 NADH，通过检测 NADH 在340nm 处的增加速率即可得出 PDH 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下，使粉体落到底部， 再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用 试剂二 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉体 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下，使粉体落到底部， 再加入 1.1mL 蒸馏水溶解备用 三、所需的仪器和用品： 紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、可调式移液器、研钵、 冰和蒸馏水。 四、脯*酸脱氢酶（PDH）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 1mL 石英比色皿（光径 1cm）中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 120 试剂一 20 试剂二 560 试剂三 20 轻轻混匀，室温（25℃）下，可先孵育 6min 后于 340nm 处读取 A1，30min 后读取 A2，△A=A2-A1。 【注】 1.若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间 T 到 60min 后或更长读取 A2，改变后的 反应时间需代入计算公式重新计算。或适当增加样本取样质量 W，则改变后的反应时 间 T 和样本质量 W 需代入计算公式重新计算。本试剂盒仅供科研使用 2 2. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对 会偏高），可以适当减少样本加样量 V1（如减至 80μL，则试剂三相应增加），则改变 后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。 或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于检测； 3．若上升趋势不稳定，可以每隔 2min 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段 T 参与 计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算 单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 PDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T=32.2×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算 单位定义：每克组织在每分钟内生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 PDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W× V1÷V) ÷T=32.2×ΔA÷W V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.12mL； V2---反应体系总体积，7.2×10-4 L； d---光径，1cm； ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； T---反应时间，30min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。