二氢黄酮醇还原酶(DFR)试剂盒,微板法

二氢黄酮醇还原酶(DFR)试剂盒,微板法

二氢黄酮醇还原酶(DFR)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)试剂盒说明书 （WS8001W 微板法 48 样） 一、产品简介： 二氢黄酮醇还原酶（DFR，EC 1.1.1.219）是花色苷合成代谢中的一个关键酶，负责将 3 种二氢黄酮醇还原成无色花色素。在决定植物的花色、叶色、果色和其他经济器官的色泽 及其营养品质方面起着重要作用。 二氢黄酮醇还原酶（DFR）作用于二氢槲皮素产生儿茶素，可与香*醛缩合形成红色化 合物，在 500nm 处有特征吸收峰进而得出 DFR 的酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体60mL×1瓶 4℃保存 试剂一 液体15mL×1瓶 4℃保存 试剂二 粉体×1 支 4℃保存 临用前离心或甩几下使试剂落入底部， 再加 1.5mL 乙醇充分溶解，4℃保存。 试剂三 粉体×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，分 别加 1.1mL 蒸馏水溶解备用。用不完的 试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融， 三天内用完。 试剂四 粉体×1 瓶 4℃保存 临用前离心或甩几下使试剂落入底部， 再加 18mL 盐酸充分溶解，4℃保存。 标准品 粉体×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、乙酸乙酯、无水乙醇、研钵、冰。 四、二氢黄酮醇还原酶（DFR）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，温度设定 25℃，调节波长至 500nm。 ② 试剂放在 40℃水浴 5min； ③ 按照下表在 EP 管中依次加入试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 130 150 试剂二 20 试剂三 10 10 混匀，40℃反应 30min 乙酸乙酯 200 200本试剂盒仅供科研使用 2 37℃震荡 10min，取上层溶液，N2 吹干 无水乙醇 100 100 充分震荡混匀，待检液按照下表操作 ④ 在 96 孔板中直接加入以下试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 待检液 50 50 试剂四 150 150 混匀，25℃静置 3min，立即于 500nm 处读取吸光 值 A（10min 内读值完成）。△A=A 测定管-A 对照 管（每个样本做一个自身对照）。 【注】：若ΔA 在零附近徘徊，可延长反应时间 T（如：50min 或更长）， 或加大样本量 V1（如增至 80μL，试剂一相应减少），重新 调整后的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为：y=0.0195x-0.0012，x 是标准品浓度（μg/mL），y 是△A。 2、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每小时分解二氢槲皮素产生1μg儿茶素所需酶量为一酶活单位（U）。 DFR(μg/h/mg prot)＝[(ΔA+0.0012)÷0.0195×V 乙醇]÷(V1×Cpr) ÷T =256.5×(ΔA+0.0012)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克样本每小时分解二氢槲皮素产生 1μg 儿茶素所需酶量为一酶活单位（U）。 DFR(μg/h/g 鲜重)＝[(ΔA+0.0012)÷0.0195×V 乙醇]÷(W×V1÷V) ÷T =256.5×(ΔA+0.0012)÷W V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.04 mL； T---反应时间，30 min=0.5h； V 乙醇---0.1mL； W---样本质量，g。 Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（1mg/mL）：临用前加 1mL 无水乙醇溶解（1mg/mL）。 2 用无水乙醇把标准品稀释成以下浓度：0，10，20，30，40，50. μg/mL。也可根据 实际来调整标准品浓度。 3 按照第④步骤测定管的加样表操作，依据结果即可制作标准曲线。