花青素还原酶（ANR）试剂盒,微板法

花青素还原酶（ANR）试剂盒,微板法

花青素还原酶（ANR）试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）试剂盒说明书 （货号：WS6001W 微板法 96 样） 一、产品简介： 花青素还原酶（ANR）参与调控花青素的含量水平以及原花青素的形成，是原花青素 单体生物合成过程中关键酶之一，在花青素积累过程中具有重要的调节作用。 花青素还原酶（ANR）在NADPH存在下使飞燕草色素转变为表没食子儿茶素和NADP+， 通过检测反应体系在 340nm 处的吸光值下降速率即可得出花青素还原酶（ANR）活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，再 加 1.2mL 蒸馏水溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×2 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，每 支分别加 0.6mL 蒸馏水溶解备用。用不 完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复 冻融，三天内用完。 试剂三 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂μg×1 支 -20℃避光 保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，再 加 1.1mL 乙醇溶解备用，用不完的试剂 分装后-20℃避光保存，禁止反复冻融。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、无水乙醇、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。 四、花青素还原酶（ANR）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min， 取上清置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 液体样本：若液体澄清可直接检测；若浑浊则 12000rpm，4℃离心 10min，取上 清置冰上待测。 2、上机检测： 1 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 2 所有试剂解冻至室温（25℃）。 3 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 150 340nm，室温（25℃）孵育 5min本试剂盒仅供科研使用 2 试剂四 10 充分混匀，立即于 340nm 处读取吸光值 A1，后于 40℃温育 20min 后，再读取吸光值 A2，△A=A1-A2。 【注】1. 若ΔA 的值在零附近徘徊，可增加样本加样量 V1（如增至 40μL，则试剂三减少至 130μL）， 则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。 2. 若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的组织样本，一般色素较高，则起始值相对会偏高）， 可以适当减少样本加样量 V1(如减至 10μL)，则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。 3. 若ΔA 的值大于 0.2，则需减少反应时间（如 40℃温育 20min 减少至 10min），则改变后的反 应时间 T 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算 酶活定义：40℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟氧化 1nmolNADPH 定义为一个酶活单位。 ANR 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr) ÷T =160.8×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算 酶活定义：40℃条件下，每克组织每分钟氧化 1nmolNADPH 定义为一个酶活单位。 ANR 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W×V1÷V) ÷T =160.8×ΔA÷W 3、按液体体积计算 酶活定义：40℃条件下，每毫升液体每分钟氧化 1nmolNADPH 定义为一个酶活单位。 ANR 活性（nmol/min/mL）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T =160.8×ΔA V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm； ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； W---样本质量，g； T---反应时间，20min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。