木质素过氧化物酶(Lip)试剂盒,微板法

木质素过氧化物酶(Lip)试剂盒,微板法

木质素过氧化物酶(Lip)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）试剂盒说明书 （货号：WS5001W 微板法 96 样） 一、产品简介： 木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解 酶系，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制 等方面具有较大的应用潜力。 木质素过氧化物酶（LiP）氧化藜芦醇生成藜芦醛，藜芦醛在 310nm 处有特征吸收峰。 通过测定 310nm 处的藜芦醛的增加速率，即可得到木质素过氧化物酶（LiP）酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体μL×1 瓶 4℃保存 临用前用前甩几下使液体落入底 部，再加 5mL 蒸馏水混匀备用。 试剂二 液体μL×1 支 4℃保存 临用前用前甩几下使液体落入底 部，再取出 3.3ul 液体至新的 EP 管 中，再加 2mL 蒸馏水混匀备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板（UV 板）、天平、研钵、低温离心机、可调式移液器。 四、木质素过氧化物酶（Lip）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注意】 若样本颜色较深（如植物叶片），可引起起始值 A1 值较大如超过 1.5，可在样本制备过程中 增加除色素步骤：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 80%乙醇冰浴匀浆，12000rpm， 4℃离心 10min，弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的沉淀中加入 1mL 提取液，混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 ② 细菌或培养细胞： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液，超声波破碎细菌或细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照数量（104）：提取液体积(mL)为 500-1000：1 的比例进行提取 ③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min，取上清液检测。 2、上机检测： 1 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 310nm。 2 所有试剂至常温状态（25℃）。 3 在 96 孔板（UV 板）中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管本试剂盒仅供科研使用 2 提取液 120 样本上清液 20 试剂一 40 试剂二 20 充分混匀，30℃条件下，10s 时于 310nm 处读 取 A1，5min 后再读取 A2，△A=A2- A1。 【注】：若ΔA 在零附近，可增加取样质量 W（如增至 0.2g 或更多），或增加样本加样体积 V1（如 增至 80μL 或更多，则加样体系中提取液相应减少），或延长反应时间 T（由 5min 增加至 10min 或更长），则改变后的 W 和 V1 和 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1．按照蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 LiP 活性(nmol/min/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=430×△A÷Cpr 2．按照样本质量计算： 酶活定义：每克样品每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 LiP 活性(nmol/min/g 鲜重)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=430×△A÷W 3．按照细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 LiP 活性(nmol/min/104 cell)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(细胞数量×V1÷V)÷T=430×△A÷细胞数量 4．按照液体体积计算： 酶活定义：每毫升培养液每分钟氧化 1nmol 藜芦醇所需的酶量为一个酶活力单位（U）。 LiP 活性(nmol/min/mL)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=430×△A ε---藜芦醛摩尔消光系数，9300L/mol/cm； d---比色皿光径，0.5cm； V---加入提取液体积，1mL； V1---反应中样本体积，0.02mL； V2---反应总体积，0.2mL=2×10-4； W---样本质量，g； T---反应时间，5min Cpr---样本蛋白浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。