锰过氧化物酶(Mnp)试剂盒,微板法

锰过氧化物酶(Mnp)试剂盒,微板法

锰过氧化物酶(Mnp)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 锰过氧化物酶（Manganese peroxidase，Mnp）试剂盒说明书 （货号：WS4001W 微板法 96 样） 一、产品简介： 锰过氧化物酶（EC1.11.1.13，Mnp）是真菌分泌的一种糖基化的胞外蛋白，含亚铁血红 素的过氧化物酶，主要存在于引起白腐的木腐菌和土壤枯草菌这两个担子真菌中，属于木 质素降解酶系，能有效的降解木质素及废水和环境中其他一些抗性物质，如腐殖质酸和包 括多环芳烃在内的多种有机污染物等。 锰过氧化物酶（Mnp）在 Mn2+存在的条件下，将二甲氧基*酚（DMP）氧化生成的产物 在 470nm 处有特征吸收峰。通过检测该产物在 470nm 处的增加速率，即可得到 Mnp 酶活 性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 瓶 4℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部，再加 2.4mL 无水乙醇溶解备用。 试剂三 粉剂×1 支 4℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.5mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂四 液体×1 支 4℃保存 用前甩几下使液体落入底部，取出 2µL 液体至新的 EP 管中，再加 1mL 蒸馏水混匀备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、天平、低温离心机、研钵、冰和蒸馏水。 四、锰过氧化物酶（ Mnp)活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌或培养细胞： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照数量（104）：提取液体积(mL)为 500-1000：1 的比例进行提取 ③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min，取上清液检测。 2、上机检测： 1 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 470nm。 2 所有试剂至常温状态（25℃）。 3 在 96 孔板中依次加入：本试剂盒仅供科研使用 2 试剂名称（µL） 测定管 样本 20 试剂一 145 试剂二 20 试剂三 10 试剂四 5 混匀，30℃条件下反应，10s 时于 470nm 处读取 A1，10min 后读取 A2，△A=A2-A1。 【注】若△A 在零附近徘徊，可增加样本量（如增至 40µL，则试剂一相应减少），或延长反应 时间 T 至 15min 或更长，则改变后的样本 V1 和反应时间 T 需代入公司重新计算。 五、结果计算： 1．按照蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量为一个酶活力单位。 MnP 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=36.4×ΔA÷Cpr 2．按照样本质量计算： 酶活定义：每克样品每分钟氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量为一个酶活力单位。 MnP 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=36.4×ΔA÷W 3．按照细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量为一个酶活力单位。 MnP 活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(细胞数量×V1÷V)÷T =36.4×ΔA÷细胞数量 4．按照液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟氧化 1nmol 的 DMP 所需酶量为一个酶活力单位。 MnP 活性(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=36.4×ΔA ε---DMP 被氧化的产物的摩尔消光系数：55000L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---加入提取液体积，1mL； V1---反应中样本体积，0.02mL； V2---反应总体积，2×10-4 L； W---样本质量，g； T---反应时间，10min Cpr---样本蛋白浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。