4-香豆酸fu酶A连接酶(4CL)试剂盒,微板法

4-香豆酸fu酶A连接酶(4CL)试剂盒,微板法

4-香豆酸fu酶A连接酶(4CL)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 4-香豆酸：辅酶 A 连接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL) 试剂盒说明书 （货号：WS3001W 微板法 96 样） 一、产品简介： 4-香豆酸：*酶 A 连接酶（4CL ，EC 6.2.1.12）是木质素生物合成的关键酶之一，位于 苯丙酸途径与木质素特异合成途径的转折点上，主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸*酶 A 酯。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程 中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。 4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下测 4-香豆酸 CoA 生成速率， 即可反映 4CL 活性。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 2.5mL 蒸馏水，于 80-100℃水浴 1-2 分钟溶解备用。 试剂三 粉剂×1 支 -20℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再加 2.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板（UV 板）、低温台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、4-香豆酸：辅酶 A 连接酶（ 4CL)活性测定： 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌或培养细胞 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取 液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照数量（104）：提取液体积(mL)为 500-1000：1 的比例进行提取 ③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min，取上清液检测。 2、 上机检测： 1 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 333nm。 2 所有试剂至常温（25℃）状态。 3 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 140 试剂二 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 20 混匀，室温（25℃）下立即于 333nm 处读取吸 光值 A1，30min 后再读取 A2，△A=A2-A1。 【注】1. 若△A 在零附近徘徊，可加大样本量（如增至 40μL，则试剂一相应减少），或延长 反应时间 T，则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。 2. 若上升趋势不稳定，可每隔 2min 读取一次吸光值，选取一段线性上升时间段来参与 计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟使吸光值变化 0.01 所需的酶量定义为一个酶活力单位。 4CL(U/mg prot)=ΔA÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=166.7×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟使吸光值变化 0.01 所需的酶量定义为一个酶活力单位。 4CL(U/g 鲜重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=166.7×ΔA÷W 3、按细菌或细胞密度计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟使吸光值变化 0.01 所需的酶量定义为一个酶活单位。 4CL(U/104 cell)=ΔA÷(500×V1÷V)÷0.01÷T=0.333×ΔA 4、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟使吸光值变化 0.01 所需的酶量定义为一个酶活单位。 4CL(U/mL)=ΔA÷V1÷0.01÷T=166.7×ΔA V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02 mL； T---反应时间，30min； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞总数，500 万。 Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。