肉桂酸4-羟基化酶(C4H)试剂盒,微板法

肉桂酸4-羟基化酶(C4H)试剂盒,微板法

肉桂酸4-羟基化酶(C4H)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 肉桂酸 4-羟基化酶（C4H）试剂盒说明书 （货号：WS1001W 微板法 96 样） 一、产品简介： 肉桂酸-4-羟基化酶（C4H，EC 1.14.13.11）是苯丙烷类代谢途径的关键酶。可有效调节 与之相应的黄酮类化合物等次生代谢产物的合成，其活性可作为植物抗性的一个生理指标。 本产品测试原理是以肉桂酸作为底物，在酶促反应的最适条件下，肉桂酸-4-羟基化酶催 化底物生成 4-羟基反式肉桂酸，其在 PH 值下，产物 4-羟基反式肉桂酸在 340nm 下有 吸收峰，进而计算出该酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 试剂规格 保存方式 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 5mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×2 瓶 -20℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部， 每瓶再加 20mL 蒸馏水溶解，用 不完的试剂分装后-20℃保存， 禁止反复冻融，一周内用完。 试剂三 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 5mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 三、所需用的仪器与用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、肉桂酸 4-羟基化酶（C4H）活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液组织，进行冰浴匀 浆。12000rpm, 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂（μL） 测定管 空白管（仅做一次） 样本 100 试剂一 50 50 试剂二 350 350 试剂三 300 400 混匀，30℃水浴反应 30min 试剂四 50 50 混匀，静置 2min 试剂五 60 60 混匀后，取 200μL 转移至 96 孔板，在 340nm 下读取 吸光值 A，△A=A 测定-A 空白。本试剂盒仅供科研使用 2 【注】若△A 的值在零附近徘徊，可增加样本加样量（如增加至 200μL，则试剂三相应减少） 或增加反应时间 T，则改变后的加样体积 V1 和 T 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1. 按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟产生 1nmol 的 4-羟基反式肉桂酸为一个酶活力单位。 C4H（nmol/min/g 鲜重）=[(△A÷ε÷d×V2×109) ]÷(W×V1÷V)÷T =24.8×ΔA÷W 3. 按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmol 的 4-羟基反式肉桂酸为一个酶活力单位。 C4H（nmol/min/mg prot）=[(△A÷ε÷d×V2×109) ]÷(V1×Cpr) ÷T =24.8×ΔA÷Cpr ε ---4-羟基反式肉桂酸在此反应条件下于 340nm 处的摩尔吸光系数，2.45×104 L/mol /cm； V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.1 mL； V2 ---反应体系总体积，910μL=9.1×10-4 L； d --96 孔板光径，0.5 cm； T---反应时间，30 min； W---样本质量，g； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。