磷脂酶D(PLD)试剂盒,微板法

磷脂酶D(PLD)试剂盒,微板法

磷脂酶D(PLD)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 磷脂酶 D（Phospholipases D，PLD）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS5290W 微板法 48 样） 一、产品简介： 磷脂酶 D（EC 3.1.4.4）即磷脂酰*碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的 一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、 信号传导、生物膜形成的抗逆境胁迫等生理功能。 磷脂酶 D 催化水解底物 O-(4-硝基苯基)胆*（NPPC），并在外加酸性磷酸酶的作用下产 生对硝基*酚(PNP)，该产物在 405nm 处有吸收峰。通过检测 PNP 在 405nm 下的增加 速率，即可得到 PLC 酶活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 用前摇匀再用。 试剂一 粉剂 mg×2 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，每支加 0.3mL 蒸馏水溶解备 用。用不完的试剂-20℃保存。 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下使粉剂落入底部，加 2.4mL 蒸馏水溶解且 5000rpm 离 心 5min，取上清液备用。用不完 的上清液-20℃保存。 试剂三 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 2.5mL×1 支 4℃保存 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、可调式移液器和蒸馏水。 四、磷脂酶 D（PLD）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实 验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的果实样本可取 0.2-0.3g），加入 1mL 提取液（用 前摇匀再用），进行冰浴匀浆，13000rpm，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s， 重复 30 次）；13000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min，调节波长到 405nm，所有试剂解冻至室温（25℃）。 ② 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 30 30 试剂一 10 试剂二 20 20本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 120 130 混匀，37℃孵育反应 30min。 试剂四 20 20 混匀，于 405nm 处读取吸光值 A，△A=A 测定-A 对照(每 个样本需做一个自身对照)。 【注】：① 若△A 的值小于 0.01，可增加样本量 V1（如增至 60μL，则试剂三相应减少）或延长反应时 间 T（如增至 60min 或更长），则改变后的 V1 和 T 须代入公式重新计算。 ② 若△A 的值超过 1，可减少样本量 V1（如减至 10μL，则试剂三相应增加）或缩短反应时间 T（如减至 10min）；或对最终的待检液用蒸馏水稀释，则改变后的 V1 和 T 和稀释倍数 D 代入计算公式； 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0576x - 0.0012，x 是 PNP 摩尔质量(nmol)，y 是△A。 2、按照样本蛋白浓度计算： 酶活定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 PLD (nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0012)÷0.0576]÷(Cpr×V1)÷T×D=19.3×(ΔA+0.0012)÷Cpr×D 3、按照样本质量计算： 酶活定义：37℃中每克组织每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 PLD (nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0012)÷0.0576]÷(W×V1÷V)÷T×D =19.3×(ΔA+0.0012)÷W×D 4、按细菌/细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 PLD (nmol/min/104 cell)=[(ΔA+0.0012)÷0.0576]÷(500×V1÷V)÷T×D=0.04×(ΔA+0.0012)×D 5、按液体体积计算： 酶活定义：37℃中每毫升液体每分钟水解 1nmol NPPC 产生 PNP 定义为 1 个酶活单位。 PLD (nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0012)÷0.0576]÷V1÷T×D=19.3×(ΔA+0.0012)×D V---提取液体积，1 mL； V1---加入反应体系中上清液体积（mL），0.03mL； T---反应时间（min），30 min； D---稀释倍数，未稀释即为 1； W ---样品质量，g； 500---细胞数量； Cpr---粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1.4ml 蒸馏水超声溶解。 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 μmol/mL。也 可根据实际样本来调整标准品浓度。 3 在 96 孔板中依次加入：30μL 标准品+150μL 试剂三+20μL 试剂四，混匀于 405nm 处 读值，根据结果即可制作标准曲线。