甘油激酶（GK）活性试剂盒,微板法

甘油激酶（GK）活性试剂盒,微板法

甘油激酶（GK）活性试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 甘油激酶（GK）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS9190W 微板法 96 样） 一、产品简介： 甘油激酶（GK，EC 2.7.1.30）是甘油代谢中的限速酶，催化甘油磷酸化产生 3-磷酸甘 油，3-磷酸甘油在 3-磷酸甘油脱氢酶的作用下产生磷酸二羟丙酮，进入糖酵解途径氧化分 解释放能量。该酶的缺乏将直接导致细胞不能利用甘油。 本试剂盒采用甘油激酶催化 Mg-ATP 依赖的甘油磷酸化为 3-磷酸甘油，3-磷酸甘油在 磷酸甘油氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢与显色剂反应在 510nm 处有吸收 峰。通过测定 510nm 处的增加速率即可得出甘油激酶的酶活力大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解 备用。用不完的试剂 4℃保存。 试剂二 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解 备用。用不完的试剂 4℃保存。 试剂三 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 9mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 液体 mL×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，临用前加 2.2mL 蒸馏水溶解 备用。用不完的试剂 4℃保存。 标准品 液体 1 mL×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、甘油激酶（GK）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）到研钵内，加入 1mL 提取液， 在冰上进行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取） ② 细菌/真菌样本：先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌/真菌加 入 1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间 隔 10s，重复 30 次）；12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：也可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取） ③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 510nm。 ② 在 96 孔板中依次加入下列试剂：本试剂盒仅供科研使用 2 【注】：加完试剂五即启动反应，所以试剂五加完需立即混匀检测，若ΔA 小于 0.05，可增加样本上样量 V1，试剂四相应减少保持原体系不变（如样本上样量为 20μL 时，试剂四为 80μL）；或延长反 应时间 T（如延长至 10min 或更长），则改变后的 V1 和 T 需带入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.1066x-0.0277：x 为 H2O2标准品浓度(μmoL/mL)，y 为ΔA。 2、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位（U）。 GK(μmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(W×V1÷V)÷T =1.88×(ΔA+0.0277)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位（U）。 GK(μmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(V1×Cpr)÷T=1.88×(ΔA+0.0277)÷Cpr 3、按细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟催化生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位（U）。 GK(μmoL/min/104cell)=[(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷(500×V1÷V)÷T=0.004×(ΔA+0.0277) 4、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟催化生成 1μmoLH2O2 定义为一个酶活单位（U）。 GK(μmoL/min/mL)= [(ΔA+0.0277)÷0.1066×V1]÷V1÷T=1.88×(ΔA+0.0277) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01mL； T---反应时间，5 min； W---样本质量； 500---细胞数量； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的蛋白含量测定试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1. 用蒸馏水把母液（250mM）稀释成以下浓度梯度的标准品：0,2,4,6,8,10mM。也可根 据实际情况来调整标准品浓度。 2. 按照测定管（样本替换为标准品）加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。 试剂名称（μL） 测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 10 试剂三 60 试剂四 90 混匀，37℃避光静止 5min。 试剂五 20 混匀，37℃下，立即于 510nm 读取吸光值 A1，避光孵育 5min 后读取 A2。ΔA=A2-A1。