3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性试剂盒,微板法

3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性试剂盒,微板法

3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 3-磷酸甘油酯酶（GPP）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS8190W 微板法 48 样） 一、产品简介： 3-磷酸甘油酯酶（GPP，EC3.1.3.21）催化 3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油，是甘 油合成过程中的最后一步酶促反应，该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。 本试剂盒采用 3-磷酸甘油为底物，用钼酸铵显色剂测定单位时间内酶催化产生的磷酸 根离子的量，进而得出 3-磷酸甘油酯酶的活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 瓶 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，临用前加 6mL 蒸馏水溶解备 用。用不完的试剂 4℃保存。 试剂二 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 A:粉体 mg×1 瓶 B:液体 2mL×1 瓶 4℃保存 临用前在试剂 A 中加 1.8mL 的 B 液，再加 23.2mL 的蒸馏水，混 匀溶解备用。用不完的试剂 4℃ 保存，若试剂变色则舍弃。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿， 免磷污染。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、EP 管、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、α-磷酸甘油酯酶（GPP）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）到研钵内，加入 1mL 提取液，在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 [注]：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 [注]：也可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 700nm。 ② 在 EP 管中依次加入下列试剂：本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 显色反应，在 96 孔板中加入： 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.5117x + 0.0026，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。 2、按蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/mg prot)= [(△A-0.0026)÷0.5117×V2] ÷（V1×Cpr）÷T=15.63×(△A-0.0026)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每小时每克组织分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/g 鲜重)= [(△A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(W× V1÷V)÷T=15.63×(△A-0.0026)÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 定义：每小时每 1 万个细菌或细胞分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h /104 cell)= [(△A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.031×(△A-0.0026) 5、按液体体积计算: 定义：每小时每毫升液体分解底物产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 GPP(μmol/h/mL)=[( △A-0.0026)÷0.5117×V2]÷V1÷T=15.63×(△A-0.0026) V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.05mL ； V2---酶促反应总体积，0.2mL； T---反应时间，1/2 小时； W---样本鲜重，g； 500---细菌或细胞总数，500 万。 Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1. 制备标准品母液（5μmol/mL）：标准品用 10mL 试剂一溶解。（母液需在两天内用）。 2. 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标 准品浓度。 3. 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 50 提取液 50 50 试剂一 50 50 混匀，37℃孵育 30min。 试剂二 50 50 样本 50 混匀，12000rpm，4℃离心 5min，取上清待测。 上清液 50 50 试剂三 200 200 混匀，室温静置 3min，700nm 下读取各管吸光值 A， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。