胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒微板法

胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒微板法

胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶活性试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶（ctGPD）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS6190W 微板法 96 样） 一、产品简介： 胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶（ctGPD，EC 1.1.1.8）的酶活水平直接决定了葡萄糖分解代谢 过程中向甘油合成方向的物质流分配量，也因此决定甘油的生成水平。 ctGPD 为 NAD 依赖型，催化磷酸二羟丙酮生成 3-磷酸甘油。通过 340nm 下测定 NADH 的下降量，进而得出 ctGPD 的酶活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×3 支 -20℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，每支分别加 0.44mL 蒸馏水溶 解备用。用不完的试剂-20℃保存， 禁止反复冻融，三天内用完。 试剂二 液体 17mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。 四、胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶（ctGPD）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）到研钵内，加入 1mL 提取液，在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 [注]：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取） ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 [注]：也可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取） ③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。 ② 在 96 孔板中依次加入下列试剂： 试剂名称（μL） 测定管 样本 20 试剂一 10 试剂二 160 试剂三 10 混匀后立即在 340nm 处读取 A1 值，5min 后读取 A2。本试剂盒仅供科研使用 2 ΔA=A1-A2。 【注】：加完试剂三即启动反应，所以试剂三加完需立即检测，若 A1 超过 1.2 或ΔA 超过 0.35，则 减少样本上样量，试剂二相应增加保持原体系不变（如样本上样量减为 10μL 时，试剂二 增为 170μL），或减少反应时间 T（如减为 2min）。则改变后的 V1 和反应时间 T 需带入 计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 ctGPD（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(W× V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W 2、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 ctGPD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(V1×Cpr)÷T =643.1×ΔA÷Cpr 3、按细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 ctGPD（nmol/min/104cell）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×ΔA 4、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟内氧化 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。 ctGPD（nmol/min/mL）=[ΔA×V2÷（ε×d）×109]÷V1÷T=643.1×ΔA V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---光径，0.5cm； ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； W---样本质量，g； T---反应时间，5min； Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。