多功能氧化酶（MFO）试剂盒,微板法

多功能氧化酶（MFO）试剂盒,微板法

多功能氧化酶（MFO）试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 多功能氧化酶 (MFO)活性测定说明书 （货号：WS5190W 微板法 96 样） 一、产品简介： 多功能氧化酶 (MFO)是生物体内重要的一种解毒酶，可使昆虫适应植物的变化；减弱或 免受植物诱导抗性产生的有毒次生物质对昆虫的毒害。 多功能氧化酶（MFO）催化对硝基苯甲醚产生对硝基*酚，该产物在 405nm 下有特征吸 收峰，通过检测该物质在 405nm 处的光吸收增加速率，进而得出 MFO 活性大小。 二、试剂盒的组成和配制： 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、多功能氧化酶 (MFO)活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min， 取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 提取液 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×2 支 4℃保存 每支用前甩几下使试剂落入底部，分 别加入 0.6mL 乙醇，*全溶解后备 用，现配现用。 试剂二 液体 6mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 粉体 mg×2 支 -20℃保存 临用前甩几下或离心使试剂落到底 部，每支加 1.2mL 蒸馏水溶解，用不 完的试剂分装后-20℃保存，禁止反 复冻融，三天内用完。 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 试剂名称（μL） 测定管 样本 50 试剂一 10本试剂盒仅供科研使用 2 【注】：若ΔA 小于 0.005，可增加样本量 V1（如增至 80μL，则试剂二相应减少），或增加取样质量 W（如增至 0.2g），则改变后的样本量 V1 和样本质量 W 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y =1.7082x-0.0005， PNP 摩尔浓度（μmoL/mL），y 是△A。 2、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织每分钟产生 1nmoL 的对硝基*酚（PNP）为 1 个酶活单位。 MFO(nmoL/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0005)÷1.7082×103×V1]÷(W×V1÷V)÷T =19.5×(ΔA+0.0005)÷W 3、按样本蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmoL 的对硝基*酚（PNP）为一个酶活单位。 MFO(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0005)÷1.7082×103×V1]÷(V1×Cpr)÷T =19.5×(ΔA+0.0005)÷Cpr 4、按细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟产生 1nmoL 的对硝基*酚（PNP）为一个酶活单位。 MFO(nmoL/min/104cell)=[(ΔA+0.0005)÷1.7082×103×V1]÷(500×V1÷V)÷T =0.039×(ΔA+0.0005) 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟产生 1nmoL 的对硝基*酚（PNP）为一个酶活单位。 MFO(nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.0005)÷1.7082×103×V1]÷V1÷T=19.5×(ΔA+0.0005) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.05mL； T---反应时间，30 min； W---样本质量，g； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的蛋白含量测定试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmoL/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1.4mL 蒸馏水超声溶解。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μmoL/ml。也可 根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。 试剂二 60 试剂三 20 混匀，立即于 405nm 处读取吸光值 A1， 37℃孵育 30min 后读取 A2，ΔA=A2-A1。