乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒,微板法

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒,微板法

乙酰fu酶A羧化酶(ACC)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 乙酰*酶 A 羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)试剂盒说明书 （货号：WS4190W 微板法 96 样） 一、产品简介： 乙酰*酶A羧化酶（ACC，EC 6.4.1.2）广泛存在于生物界。在生物体内催化乙酰*酶A 羧化生成丙二酰*酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定 程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。 ACC催化乙酰*酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰*酶A、无机磷和ADP，ADP与磷酸烯 醇式丙酮酸在丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的逐一作用下，使NADH氧化为NAD+，通过检测 NADH在340nm处的下降量来计算ACC的酶活力大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 100mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂二 粉剂 mg×4 支 -20℃保存 每支用前甩几下使试剂落入底部，再 加 0.55mL 的蒸馏水溶解备用。用不 完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复 冻融，三天内用完。 试剂三 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。 试剂四 液体 15mL×1 瓶 4℃保存 试剂五 粉剂 mg×1 支 -20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、乙酰*酶 A 羧化酶（ACC）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min，取上 清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取 ② 细胞样本： 先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入 1mL 提取液；超声波破碎 细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm 离 心 10min，取上清作为待测样品。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104)：提取液(mL)为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊离心后取上清测定。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，设置温度 37℃,调节波长至 340nm。本试剂盒仅供科研使用 2 ② 试剂放在 37℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入： 试剂名称 测定管 样本 10 试剂一 10 试剂二 20 试剂三 10 试剂四 150 混匀，37℃下，孵育 10min 试剂五 10 混匀，37℃下，立即于 340nm 处读取吸光值 A1， 10min 后读取 A2，△A=A1-A2。 【注】：1.若ΔA 过小，可以延长反应时间（如：22min 或更长）再读取 A2，或增加样本加样量 V1（如 增至 40μL，则试剂四相应减小），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。 2.若 A2 值小于 0.45 或△A 大于 0.6，则需缩短反应时间 T（如减至 12min）再读取 A2 或减少样 本量 V1（如减至 5μL，则试剂四相应增加），重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重 新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 ACC(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 ACC(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W 3、按细胞密度计算： 单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 ACC(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×ΔA 4、按液体体积计算： 单位定义：每毫升液体样本每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 ACC(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=643.1×ΔA ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； T---反应时间，10 min； W---样本质量，g； 500---细胞数量； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。