氨基酸(AA)含量试剂盒,微板法

氨基酸(AA)含量试剂盒,微板法

氨基酸(AA)含量试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 氨基酸(amino acid, AA)含量测定试剂盒说明书 （货号：WS5140W 微板法 96 样） 一、产品简介： 氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质分解产物的种类之一。游离氨基酸与果蔬 品质，采后生理，氮素代谢等有密切的关系。也能反映动物肝脏、肾脏的生理状态。 本试剂盒采用茚三酮显色法测定氨基酸：在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热能产生蓝 紫色化合物二酮茚胺，经光谱扫描在 570 nm 有特征吸收峰；通过测定 570 nm 吸光度，来 计算氨基酸含量。 二、测试盒组成和配制： [注]：粉剂量在 mg 级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵、无水乙醇、冰和蒸馏水。 四、氨基酸(AA)含量的测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.2g 组织），加入 1mL 提取液，进行室温匀浆， 12000rpm，4℃离心 10min，上清液置冰上待测。 [注]:也可按照组织质量（g）提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 ② 细菌或细胞样本： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液， 进行室温匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，上清液置冰上待测。 [注]:也可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30 min，调节波长到 570 nm。 ② 在 EP 管中按照下表依次加入试剂： 试剂名称（μL） 测定管 空白管（只做一次） 蒸馏水 40 上清液 40 反应 mix 560 560 试剂三 40 40 混匀，盖紧盖（可用封口膜缠绕，防止水分散失）， 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×4 瓶 4℃保存 临用前每瓶加入 1.5mL 无水乙醇，盖 紧后充分混匀，再加入 13.5mL 试剂 一混匀制备成反应 mix,10 天内用完。 试剂三 粉剂×1 支 4℃保存 临用前加 4.5mL 蒸馏水,充分溶解 标准品 液体×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂本试剂盒仅供科研使用 2 置沸水浴中 15 min，取出后冷却至室温并摇晃混匀约 1min。 95%乙醇 320 320 混匀，取 200μL 澄清液体（若浑浊可 8000rpm 室温离心 5min） 于 96 孔板中，在 570nm 读取吸光值 A，△A=A 测定- A 空白。 【注】若 A 测定值大于 1.5，可用蒸馏水把上清液稀释后再按照加样表重新测定， 则稀释倍数 D 代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.3963x + 0.006；x 是标准品摩尔浓度(μmol/mL)，y 是ΔA。 2、按样本质量计算： 氨基酸含量(μmol/g 鲜重)=[(ΔA-0.006)÷0.3963×V1]÷(V1÷V×W)×D =2.52×(ΔA-0.006)÷W×D 3、按细胞数量计算： 氨基酸含量(μmol/104 cell)=[(ΔA-0.006)÷0.3963×V1]÷(V1÷V×细胞数量)×D =2.52×(ΔA-0.006)÷细胞数量×D 4、按照液体体积计算： 氨基酸含量(μmol/mL)=[(ΔA-0.006)÷0.3963×V1]÷V1×D=2.52×(ΔA-0.006)×D V---样品提取液总体积，1mL； V1---加入样本体积，0.04 mL； W---样品质量，g。 D---稀释倍数，未稀释即为 1； 附：标准曲线制作过程： 1 标准品母液（10μmol/mL）； 2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.μmol/mL。也可 根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。