亚硝酸还原酶(NiR)试剂盒

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亚硝酸还原酶(NiR)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒说明书 （货号：WS8040F 分光法 48 样） 一、产品简介： 亚硝酸还原酶（NiR，EC1.7.2.1）是一类能催化亚硝酸盐还原的氧化还原酶，广泛存在于微生物及植 物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为 NO 或 NH3，从而减少环境中亚硝态 氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。 亚硝酸还原酶可将 NO2 -还原为 NO，使样品中参与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成（粉）红色偶氮化 合物的 NO2 -减少，根据颜色深浅即 540nm 处吸光值的变化可反应亚硝酸还原酶的活性。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉体 mg×4 支 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，每 支加 1.5mL 提取液溶解。 试剂二 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再 加 4mL 提取液溶解。 试剂三 试剂三 Amg×2 支 试剂三 Bmg×2 支 4℃保存 临用前一支试剂 A 和 B 分别用 1mL 蒸馏水wan全溶解，再把 1mL 试剂 B 倒入 1mL 试剂 A 中混成试 剂三 mix(一周内用完)。 试剂四 粉体 g×1 瓶 4℃保存 临用前加 6mL 蒸馏水溶解。 试剂五 液体 24mL×1 瓶 4℃保存 临用前，可依据待检测样本数量， 把试剂五和六等比例混合成无色 的反应 mix（注意观察，若变粉色， 则不能使用）。 两天之内用完。 试剂六 液体 24mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、天平、研钵、水浴锅、 低温离心机。 四、亚硝酸还原酶（NiR）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000g 离心10min， 取上清，置冰上待测。 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞 加入 1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）； 4℃×12000g 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，按照细菌/细胞数量(104个)：提取液体积(mL)为 500~1000：1 的比例进行提取。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min，调波长至 540nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入试剂： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 50 50本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 50 提取液 330 430 样本 20 20 试剂三 mix 50 混匀（此时反应液应为深蓝色），于 37℃下反应 30min 后，立即于漩涡 震荡仪上剧烈震荡直到颜色wan全消失。 试剂四 50 50 混匀，12000rpm，室温离心 5min，上清液待测。 ③ 显色反应，在 EP 管中依次加入： 上清液 80 80 蒸馏水 400 400 反应 mix 400 400 混匀，室温反应 10min，立即取全部上清液至 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中，于 540nm 处读取吸光值 A，△A =A 对照- A 测定（每个测定 管需设一个对照管）。 【注】：1. 若△A 值在零附近徘徊，可增加样本体积 V1（如增至 50μL 或更多，则提取液相应减少），或延 长反应时间 T（如增至 1h），则改变后的 V1 或 T 代入计算公式重新计算。 2. △A 值需小于 0.8，若大于则需减少样本体积 V1（如减至 10μL 或更少，则提取液相应增加）， 或缩短反应时间 T（如减至 10min），则改变后的 V1 或 T 代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 3.2526x + 0.0114，x 为标准品摩尔浓度（μmol/mL），y 为吸光值△A。 2、按照蛋白含量计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。 NiR(μmol/h/mg prot)=[(△A-0.0114)÷3.2526×V2]÷(V1×Cpr)÷T=16.91×(△A-0.0114)÷Cpr 3. 按照样本质量计算： 酶活定义：每克组织每小时还原 1μmol NO2 ˉ的量为一个酶活力单位。 NiR(μmol/h/g 鲜重)=[(△A-0.0114)÷0.3127×V2]÷(W×V1÷V)÷T=16.91×(△A-0.0114)÷W 4. 按照细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每小时还原 1μmol NO2 ˉ的量为一个酶活力单位。 NiR(μmol/h /104 cell)=[(△A-0.0114)÷0.3127×V2]÷(细胞数量×V1÷V)÷T =16.91×(△A-0.0114)÷细胞数量 V1---体系中加入样本体积，0.02mL； V---加入提取液体积，1mL； V2---反应阶段总体积，0.55mL； T---反应时间，30min=1/2h； 细胞数量---500 万； W---样本质量，g； Cpr---样本蛋白含量，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（100μmol/mL）：标准品用 1mL 蒸馏水溶解。（母液在两天内用完）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2,0.25. μmol/mL。 3 按照显色反应阶段的加样顺序操作：根据结果即可制作标准曲线。