蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)试剂盒,微板法

蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)试剂盒,微板法

蔗糖合成酶SS-Ⅱ(合成方向)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 蔗糖合成酶（合成方向；SS-Ⅱ）试剂盒说明书 （货号：WS2150W 微板法 48 样） 一、产品简介： 蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。 蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，EC 2.4.1.13）是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化 蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。研究其合成方向 SS-Ⅱ的活性对于植物蔗糖合成具 有重要意义。 SS-Ⅱ催化游离果糖与葡萄糖供体 UDPG 反应生成蔗糖，采用蔗糖与间苯*fen反应生成 的有颜色产物在 480nm 下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色深浅成正比。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60ml×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 2.1ml×1 支 -20℃保存 试剂二 液体 1ml×1 支 4℃保存 试剂三 液体 20ml×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉剂 mg×2 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部，每 瓶加入 4mL 蒸馏水充分溶解，现配 现用，一周内用完。 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、移液器、蒸馏水。 四、蔗糖合成酶（SS-Ⅱ）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12,000rpm 4℃离心 10min，取上清作为待测样品。 【注意】 若样本含糖量高，可引起 A 对照值较大如超过 1.6，即检测背景值过高会影响检测，可在样本 制备过程中增加除糖步骤：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 经预冷的 95%乙醇 冰浴匀浆，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀，向沉淀中加入经预冷的 80% 乙醇混匀，4℃放置 5min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 经预冷 提取液涡旋混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 10min；留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 液体样本：直接测定。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 480nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 40 蒸馏水 40 样本 20 20 37℃水浴 20min 试剂二 10 10本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二需直接加到反应液里面，且务必混匀（可用枪头吸 打），95℃水浴煮沸 10min（可用封口膜缠紧，防止水分散 失），冷却至室温。 试剂三 200 200 试剂四 60 60 混匀，95℃水浴 20min，冷却后，取 200μL 至 96 孔板中， 480nm 下测定。ΔA=A 测定管-A 对照管（每个测定管需设 一个对照管）。 【注】：若ΔA 值过小如在零附近徘徊，可延长 37℃水浴时间 T（如 40min 或更长）或增加样本取样 量 W（如增至 0.2g），或者增加样本加样体积 V1（如 40μL，则试剂三相应减少），相应的变 量重新代入计算公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0053x - 0.0044；x 为蔗糖标准品质量（μg），y 为ΔA。 2、按照蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅱ活性(μg /min/mg prot)=[(ΔA+0.0044)÷0.0053]÷(V1×Cpr) ÷T =471.7×(ΔA+0.0044) ÷Cpr 3、按照样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟催化产生 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅱ活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0044)÷0.0053]÷(W×V1÷V) ÷T =471.7×(ΔA+0.0044)÷W 4、按照液体体积计算： 单位定义：每毫升液体每分钟催化产生 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅱ活性(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0044)÷0.0053]÷V1÷T=471.7×(ΔA+0.0044) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02 mL； T---反应时间，20 min； W---样本质量，g； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 2, 4, 6, 8, 10. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 按照：20μL 标准品+40μL 蒸馏水+10μL 试剂二+200μL 试剂三+60μL 试剂四，依次 加样操作，95℃水浴 20min，冷却后，取 200μL 至 96 孔板中，480nm 下测定，根 据结果即可制作标准曲线。