蔗糖合成酶SS-I(分解方向)试剂盒,微板法

蔗糖合成酶SS-I(分解方向)试剂盒,微板法

蔗糖合成酶SS-I(分解方向)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 蔗糖合成酶（分解方向；SS-Ⅰ）试剂盒说明书 （货号：WS3150W 微板法 48 样） 一、产品简介： 蔗糖是叶片等光合产物向各器官运输的主要形态。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之 一。研究其分解方向 SS-Ⅰ的活性对于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意义。 SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游离果糖和UDPG，采用3,5－二硝基水杨酸法在540nm测定果 糖的含量来反映酶活性的高低。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 A：液体 1.1mL×2 支 B：粉体 mg×2 支 4℃保存 临用前一支 A 液全部转移至一 支 B 粉体中，溶解待用， 仍-20℃保存。 -20℃保存 试剂二 液体 1.5mL×1 支 4℃保存 试剂三 液体 6mL×1 棕色瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、移液器、蒸馏水。 四、蔗糖合成酶（分解方向；SS-Ⅰ）活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，在 4ºC 或冰浴进行 匀浆(或使用各类常见电动匀浆器)。12,000rpm，4ºC 离心 10min，取上清作为待测样品。 【注意】 若样本含糖量高，可引起 A 对照值较大如超过 1.6，即检测背景值过高会影响检测，可在样本 制备过程中增加除糖步骤：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 经预冷的 95%乙醇 冰浴匀浆，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀，向沉淀中加入经预冷的 80% 乙醇混匀，4℃放置 5min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 经预冷 提取液涡旋混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 10min；留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 液体样本：直接测定。 若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 试剂一 40 蒸馏水 40 样本 10 10 37℃准确水浴 30min 后，95℃水浴 5min 试剂二 10 10 试剂三 50 50 95℃水浴 10min（可用封口膜缠紧，防止水份散失），本试剂盒仅供科研使用 2 取出后冰浴或淋浴至室温 蒸馏水 200 200 混匀，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下测定各管吸光值。 ΔA=A 测定管-A 对照管（每个测定管都需设一个对照管）。 【注】：1. 若ΔA 值过小如在零附近徘徊，可增加样本的加样体积 V1（如 20μL，则蒸馏水相应减少） 或增加样本取样量 W（如增至 0.2g），或者延长 37℃水浴时间 T（如 40min 或更长），相 应的变量重新代入计算公式计算。 2. 若 A 测定的值大于 1.5，则可对加入 96 孔板前的的液体用蒸馏水稀释，则稀释倍数 D 需 代入计算公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 0.0128x - 0.0324；x 为标准品质量（μg），y 为ΔA。 2、按照蛋白浓度计算： 单位定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1 μg 果糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷(V1×Cpr)÷T ×D =260.42×(ΔA+0.0324) ÷Cpr×D 3、按照样本鲜重计算： 单位定义：每克组织每分钟催化产生 1 μg 果糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷(W×V1÷V)÷T×D =260.42×(ΔA+0.0324)÷W×D 4、按照液体体积计算： 单位定义：每毫升液体每分钟催化产生 1 μg 果糖定义为一个酶活力单位。 SS-Ⅰ活性(μg/min/mL)=[(ΔA+0.0324)÷0.0128]÷V1÷T×D =260.42×(ΔA+0.0324)×D V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01 mL； T---反应时间，30 min； W---样本质量，g； D---稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 2, 4, 6, 8, 10. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 依据对照管加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。