中性转化酶(NI)/细胞质试剂盒,微板法

中性转化酶(NI)/细胞质试剂盒,微板法

中性转化酶(NI)/细胞质试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 中性/碱性转化酶（Neutral invertase, NI）试剂盒说明书 （货号：WS6150W 微板法 48 样） 一、产品简介： 蔗糖酶即蔗糖转化酶（Invertase，E.C.3.2.1.26）在蔗糖代谢中催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖，是高等 植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 PH 值，蔗糖转化酶分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两 种类型，许多报道均将中性转化酶同碱性转化酶看作一种转化酶。NI 的最适 PH 值在 7.0 左右，主要存 在于细胞质中，负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。 NI 催化蔗糖分解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，经光谱扫 描在 540nm 有特征光吸收，在一定范围内 540nm 光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速 率来计算 NI 活性 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 瓶 4℃保存 用前加入 7.5mL 试剂一充分溶 解备用；用不完的试剂 4℃保存; 试剂三 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、中性/碱性转化酶（NI）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称样本 0.1g（水分充足的样本可取 0.5g）于研钵中，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆后 转入离心管中。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注意】 若样本含糖量高，可引起 A 对照值较大如超过 1.6，即检测背景值过高会影响检测，可在样本 制备过程中增加除糖步骤：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 经预冷的 95%乙醇 冰浴匀浆，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀，向沉淀中加入经预冷的 80% 乙醇混匀，4℃放置 5min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀。再向沉淀中加入 1mL 经预冷 提取液涡旋混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 10min；留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 100 200 试剂二 100 混匀，37℃准确水浴 20min 后，95℃水浴 10min（用封口 膜缠紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀（以保 证浓度不变）。 试剂三 100 100 混匀，95℃水浴 10min（用封口膜缠紧，以防止水分散失）， 流水冷却后充分混匀，吸取 200μL 转移至 96 孔板中，本试剂盒仅供科研使用 2 540nm 处读取吸光值 A，ΔA=A 测定-A 对照（每个测定 管需设一个对照管）。 【注】：1.若吸光值大于 1.5，可以用蒸馏水稀释样本后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数 D。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加样本加样体积 V1（如增至 80μL，则试剂一相应减少）， 或延长 37℃水浴时间（如增至 40min 或更长），则相应的 V1 和 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 0.0056x - 0.0153；x 为标准品质量（μg），y 为ΔA。 2、按蛋白浓度计算： 单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 NI 活性(μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.0153)÷0.0056]÷(V1×Cpr)÷T =223.2×(ΔA +0.0153 )÷Cpr 3、按鲜重计算： 单位定义：37℃每克组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 NI 活性(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0153)÷0.0056]÷(W×V1÷V2)÷T =223.2×(ΔA +0.0153 )÷W V---加入提取液体积，1mL； V1---加入反应体系中样本体积，0.04mL； T---反应时间，20min； W---样本鲜重，g； Cp---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 按照：40μL 标准品+200μL 试剂一+100μL 试剂三，依次加样操作，95℃水浴 10min， 冷却后，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下测定，根据结果即可制作标准曲线。