细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒微板法

细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒微板法

细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 细胞壁不溶性酸性转化酶（B-AI）试剂盒说明书 （货号：WS8150W 微板法 48 样） 一、产品简介： 蔗糖酶即蔗糖转化酶（Invertase，E.C.3.2.1.26）在蔗糖代谢中催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖，是高等 植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 PH 值，蔗糖转化酶分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两 种类型，许多报道均将中性转化酶同碱性转化酶看作一种转化酶。 AI 的最适 pH 为 3.0～5.0，AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI（B-AI：cell-wall binding acid invertase）两种类型，前者分布在液泡中或细胞自由空间，后者存在于细胞间隙并结合在细胞壁上。B-AI 主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，以维持库源之间蔗糖的浓度。 B-AI 催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，经光谱 扫描在 540nm 有特征光吸收，在一定范围内 540nm 光吸收增加速率与 B-AI 活性成正比。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 A 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 提取液 B 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 瓶 4℃保存 用前加入 7.5mL 试剂一充分溶解 备用；用不完的试剂 4℃保存; 试剂三 液体 10mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、细胞壁不溶性酸性转化酶（B-AI）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 按照组织质量（g）：提取液 A 体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液 A），进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 10min，弃上清，留沉淀。 ② 沉淀中加入 1mL 蒸馏水，震荡混匀，12000rpm4℃离心 10min，弃上清，留沉淀。 ③ 沉淀中加入 1mL 提取液 B 充分混匀，4℃浸提过夜，12000 rpm 4℃离心 20min，取 上清置冰上待测。 2、上机检测： 1 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 40 40 试剂一 100 200 试剂二 100 混匀， 37℃准确水浴 20min 后，95℃水浴 10min（用封口膜缠紧， 以防止水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变） 试剂三 100 100 混匀，95℃水浴 10min（用封口膜缠紧，以防止水分散失），流水冷本试剂盒仅供科研使用 2 却后充分混匀，吸取 200μL 转移至 96 孔板中，540nm 处读取吸光值 A，ΔA=A 测定-A 对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】：1.若吸光值大于 1.5，可以用蒸馏水稀释样本后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数 D。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加样本加样体积 V1（如增至 80μL，则试剂一相应减少），或延 长 37℃水浴时间（如增至 40min 或更长），则相应的 V1 和 T 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 0.007x - 0.0234；x 为标准品质量（μg），y 为ΔA。 2、按蛋白浓度计算： 单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0234)÷0.007]÷(V1×Cpr)÷T×D =178.6×(ΔA+0.0234)÷Cpr×D 3、按鲜重计算： 单位定义：37℃每克组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 细胞壁不溶性酸性转化酶(B-AI)(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0234)÷0.007]÷(W×V1÷V)÷T×D =178.6×(ΔA+0.0234)÷W×D V---加入提取液体积，1mL； V1---加入反应体系中样本体积，0.04mL； T---反应时间，20min； W---样本鲜重，g。 D---稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（5mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天 内用且-20℃保存）。 2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 按照：40μL 标准品+200μL 试剂一+100μL 试剂三，依次加样操作，95℃水浴 10min， 冷却后，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下测定，根据结果即可制作标准曲线。