ADPG焦磷酸化酶,微板法

ADPG焦磷酸化酶,微板法

ADPG焦磷酸化酶,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase， AGP）活性测定试剂盒说明书 （货号：WS6350W 微板法 96 样） 一、产品简介： ADPG 焦磷酸化酶(AGP，EC 2.7.7.27)是植物淀粉合成过程中起关键性调节作用的酶， 催化 l-磷酸葡萄糖(G-1-P)与三磷酸腺苷(ATP)反应形成淀粉合成的直接前体腺苷二磷酸葡 萄糖(ADPG)，在植物中，主要存在于贮藏器官和叶片中。 AGP 催化的逆向反应生成 G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖 脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下测定 NADPH 增加速率，即可 计算 AGP 活性。 二、测试盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体120mL×1瓶 4℃保存 试剂一 粉体mg×1支 -20℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再 加1.1mL蒸馏水溶解，仍-20℃保存。 试剂二 粉体mg×1支 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再 加1.1mL蒸馏水溶解。仍4℃保存。 试剂三 液体13mL×1瓶 4℃保存 试剂四 粉体mg×1支 -20℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再 加 2.1mL 蒸馏水溶解，仍-20℃保存。 【注】：粉剂量在 mg 级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.2g），加 1mL 提取液，进行冰浴匀浆， 12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：也可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。 【注意】 若样本颜色较深（如较深颜色的植物叶片），可引起起始值 A1 值较大如超过 1.5，可在样本 制备过程中增加除色素步骤：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 80%乙醇冰浴匀浆， 12000rpm，4℃离心 10min，弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复 2 次。最后向离心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液，混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 ② 液体样品：澄清的液体样本直接检测；若浑浊则离心后取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，设定温度为 30℃。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 96 孔板中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 样本 40 试剂一 10本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 10 试剂三 120 轻轻混匀，30℃孵育 10min。 试剂四 20 轻轻混匀，反应开始，30℃条件下，30S 在 340nm 处读取 吸光值 A1，30min 后读取 A2，△A=A2-A1。 【注】1. 若ΔA 在零附近徘徊，可延长反应时间 T 至 60min 后或更长读取 A2；或加大样本上样量 V1（如增至 80μL，则试剂三相应减少，保持总体积不变）；或增加样本取样质量 W； 则改变后的 T 和 V1 以及 W 需代入计算公式重新计算； 2. 若上升趋势不稳定，可以每隔 10S 读取一次吸光值，选取一段线性上升的时间段来参与 计算，相对应的 A1 和 A2 值也代入计算公式重新计算。 3. 若△A 的值大于 0.4，需缩减反应时间 T（如减至 10min 或更短），或减少样本上样量 V1 （如减至 20μL，则试剂三相应增加，保持总体积不变）；则改变后反应时间 T 和 V1 需 代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、按样本蛋白蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。 AGP(nmol/min /mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=53.6×ΔA÷Cpr 2、按照样本鲜重计算 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 AGP(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=53.6×ΔA÷W 3、按照液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 AGP(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T =53.6×ΔA ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.04mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---比色皿光径，0.5cm； T---反应时间，30min； W---样本质量，g ； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。