淀粉去分支酶(DBE)试剂盒,微板法

淀粉去分支酶(DBE)试剂盒,微板法

淀粉去分支酶(DBE)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 淀粉脱分支酶（Starch debranching enzyme，DBE）试剂盒说明书 （货号：WS0450W 微板法 48 样） 一、产品简介： 淀粉去分支酶(DBE)（EC 3.2.1.68）属于淀粉水解酶家族，特异性地水解支链淀粉的 α-1，6 糖苷键，产生线性的葡萄糖链，在调整支链淀粉分子的链长方面有重要的作用。 采用 3，5-二硝基水杨酸法测定 DBE 催化支链淀粉产生的还原糖，通过测定还原糖 含量的变化来得到 DBE 酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下，使试剂落入底部，再加 24mL 试剂一，于 80℃水浴锅中溶解呈透 明状态，待冷却后使用。 试剂三 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 液体 12mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调式移液器、水浴锅、台式离心机、研钵、冰、蒸馏水 四、淀粉脱分支酶（DBE）活性检测： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取 上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 2、上机检测： 1 酶标仪预热 30min 以上，调节波长到 540 nm。 2 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 20 20 （95℃煮沸 10min 的酶液） 试剂二 200 200 37℃孵育 30min 试剂三 280 280 试剂四 100 100 混匀，95℃显色 10min 后，流水冷却至室温后，取出 200μL 至 96 孔板中，于 540nm 处读取吸光值 A，ΔA＝A 测定-A 对照。 【注】若ΔA 差值较小，可加大样本量，或延长孵育时间至 1 小时或更长。本试剂盒仅供科研使用 2 则改变后的加样量 V1 或反应时间 T 需重新代入公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线：y = 2.5359x - 0.0196，x 是标准品质量（mg），y 是ΔA。 2、按照蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克组织蛋白每小时水解支链淀粉产生 1mg 还原糖（以麦芽糖计）定义为 一个酶活力单位。 DBE 活力(mg/h/mg prot)=[ (ΔA+0.0196)÷2.5359]÷(V1×Cpr)÷T =39.43× (ΔA+0.0196) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算 酶活定义：每克组织每小时水解支链淀粉产生 1mg 还原糖（以麦芽糖计）定义为一个酶 活力单位。 DBE 活力(mg /h/g 鲜重)=[ (ΔA+0.0196)÷2.5359]÷(W×V1÷V)÷T =39.43× (ΔA+0.0196) ÷W V----加入提取液体积，1 mL； V1----反应中样品体积，20μL=0.02mL； W----样品质量，g； T----反应时间，30min=0.5h； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（50mg/mL）：临用前加 1mL 蒸馏水，充分溶解混匀。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,5,10,15,20, 25mg/mL。也可根据实际样本来 调整标准品浓度。 3 按照测定管加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。