α-葡萄糖苷酶(α - GC)试剂盒,微板法

α-葡萄糖苷酶(α - GC)试剂盒,微板法

α-葡萄糖苷酶(α - GC)试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, α-GC）试剂盒说明书 （货号：WS1250W 微板法 48 样） 一、产品简介： α-葡萄糖苷酶（α-GC，EC 3.2.1.20) 又叫α-D-葡萄糖苷水解酶，广泛分布于动植物和微生物中，是一 类能够从含有α-糖苷键底物的非还原端催化水解 a-1,4-糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基 转移到另一糖类底物形成α-1，6 糖苷键，从而得到低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等物质。α-葡萄糖苷酶与 淀粉及糖原等糖代谢密切相关，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用。 α-葡萄糖苷酶可以水解对-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成对-硝基*酚，后者在 405nm 有吸收峰， 通过测定吸光值升高速率来计算α-葡萄糖苷酶活性。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部，再加 2.5mL 蒸馏水溶解，4℃保存。 试剂二 液体 8mL×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体32mL×1瓶 4℃保存 标准品 粉剂 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、α-葡萄糖苷酶（α-GC）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴 匀浆。15000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞，加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次）；15000 rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例 进行提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 40 蒸馏水 40 试剂二 50 50 迅速混匀，37℃保温 30min本试剂盒仅供科研使用 2 试剂三 300 300 混匀， 取 200μL 至 96 孔板中，405nm 处测定吸光值 A， ΔA=A 测定-A 对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】若ΔA 较小，可以增加 37℃保温反应时间（如 1 小时）,或者增加样本上样量 V1（如增至 30μL， 则试剂二相应减少），则改变后的反应时间 T 或加样体积 V1 需重新代入计算公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.029x - 0.0143；x 是 PNP 摩尔质量（nmol）， y 是△A。 2、按样本蛋白浓度计算： 定义：每毫克组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义为一个酶活性单位。 α-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(V1×Cpr)÷T=114.9×(ΔA+0.0143)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 定义：每克组织每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义为一个酶活性单位。 α-GC 活性(nmol/min/g 鲜重)= [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(W×V1÷V)÷T=114.9×(ΔA+0.0143) ÷W 4、按细菌或细胞密度计算： 定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义为一个酶活性单位。 α-GC 活性(nmol/min/104cell) = [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(500×V1÷V)÷T =0.23×(ΔA+0.0143) 5、按液体体积计算： 定义：每毫升样本每分钟产生 1nmol 对-硝基*酚（PNP）定义为一个酶活性单位。 α-GC 活性(nmol/min/mL)= [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷V1÷T=114.9×(ΔA+0.0143) V----加入提取液体积，1mL； V1----加入反应体系中样本体积，10μL=0.01mL； W----样本质量，g； 500----细胞或细菌总数，500 万； T----反应时间，30min； PNP 对分子质量----139.11； Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mg/mL。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 在 EP 管加入：10μL 标准品+40μL 蒸馏水+50μL 试剂二+300μL 试剂三，混匀，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下读取吸光值。 4 根据结果制作标准曲线。