内切-β1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒微板法

内切-β1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒微板法

内切-β1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶试剂盒说明书 （货号：WS3350W 微板法 96 样） 一、产品简介： 内切-β-1,4-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，是纤维素酶系的组份 之一，这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将无定形长链纤维素分子截短，将其分解成葡萄糖、 纤维二糖、纤维三糖等各种类型的还原糖，在碱性条件下，产生的还原糖能与3,5-二硝基 水杨酸反应生成棕红色物质，该物质在540nm下有吸收峰，即可得出内切-β-1,4-葡聚 糖酶的酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 110mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 32mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 瓶 4℃保存 临用前加 16mL 试剂一，80℃水 浴，搅拌至溶解，仍 4℃保存。 试剂三 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织：称取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 1mL 经预冷的 95%乙醇冰浴 匀浆，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀，向沉淀中加入经 预冷的 80%乙醇混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀。 再向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液，涡旋混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 10min；留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间 隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500：1 比例进行提取。 ③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min， 取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 50 50 试剂一 150 试剂二 150 37℃孵育 60min 试剂三 150 150本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，95℃水浴 5min，取出后用自来水或冰水冷却至室温， 取 200μL 澄清液体于 96 孔板中，在 540nm 处读取吸光值 A，ΔA=A 测定管-A 对照管（每个样本做一个对照管）。 【注】若ΔA 在零附近如低于 0.005，可增加样本取样质量 W 或增加样本加样体积 V1（如增至 80μL， 则试剂三相应减少），则改变后的 W 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 0.0132x - 0.0545；x 为标准品质量（μg），y 为ΔA。 2、按照蛋白浓度计算 单位定义：每毫克组织蛋白每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(Cpr×V1) ÷T =1515.2×(ΔA+0.0545) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算 单位定义：每克组织每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(W×V1÷V) ÷T =1515.2×(ΔA+0.0545)÷W 4、按细菌/细胞密度计算 单位定义：每 1 万个细菌或细胞每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(500×V1÷V) ÷T =3×(ΔA+0.0545) 5、按液体体积计算 单位定义：每毫升液体每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 内切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维素酶活力(μg /h/mL)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷V1÷T =1515.2×(ΔA+0.0545) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.05 mL； T---反应时间，60 min=1 小时； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（2mg/mL）：从标准品管中称量取出 4mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸馏水混匀溶解即 2mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. mg/mL。也可 根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据对照管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。