外切-β-1,4-葡聚糖酶(CBH)试剂盒

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本试剂盒仅供科研使用 1 外切-β-1,4-葡聚糖酶/纤维二糖水解酶（CBH）试剂盒说明书 （货号：WS4350F 分光法 48 样） 一、产品简介： 外切-β-1,4-葡聚糖酶又称纤维二糖水解酶（CBH）（EC 3.2.1.91）存在于细菌、真菌和 动物体内，是纤维素酶系的组份之一，该酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖（还 原糖）分子，在碱性条件下，产生的还原糖能与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质， 该物质在540nm下有吸收峰，即可得出外切-β-1,4-葡聚糖酶的酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 60mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 33mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂×1 瓶 4℃保存 临用前加 16.5mL 试剂一，充分混 匀呈分散状态，每次用前务必混匀。 试剂三 液体 33mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、离心机、可调式移液器、研 钵、冰和蒸馏水。 四、外切-β-1,4-葡聚糖酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织：称取约 0.2g 组织（水分充足的样本可取 1g），加入 1mL 经预冷的 95%乙醇冰 浴匀浆，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀，向沉淀中加入 经预冷的 80%乙醇混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 5min；弃上清，留沉淀。 再向沉淀中加入 1mL 经预冷提取液，涡旋混匀，4℃放置 10min；12000rpm，4℃离心 10min；留上清，弃沉淀。上清液置冰上待测。 ② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或 细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500：1 比例进行提取。 ③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min，取上清液检测。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），试剂二使用前务必混匀。 ③ 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 100 100 试剂一 300 试剂二 300 37℃孵育 60min 试剂三 300 300本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，95℃水浴 5min，取出后用自来水或冰水冷却至室温， 取全部澄清液体于 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中，在 540nm 处读取吸光值 A，ΔA=A 测定管-A 对照管（每个样 本做一个对照管）。 【注】若ΔA 在零附近，可增加样本取样质量 W 或增加样本加样体积 V1（如增至 150μL， 则试剂三相应减少），则改变后的 W 和 V1 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为 y = 0.0099x - 0.0747；x 为标准品质量（μg），y 为ΔA。 2、按照蛋白浓度计算 单位定义：每毫克组织蛋白每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 外切-β-1,4-葡聚糖酶活力(μg/h/mg prot)=[( ΔA+0.0747)÷0.0099]÷(Cpr×V1) ÷T =1010.1×( ΔA+0.0747)÷Cpr 3、按样本鲜重计算 单位定义：每克组织每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 外切-β-1,4-葡聚糖酶活力(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0747)÷0.0099]÷(W×V1÷V) ÷T =1010.1×( ΔA+0.0747)÷W 4、按细菌/细胞密度计算 单位定义：每 1 万个细菌或细胞每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 外切-β-1,4-葡聚糖酶活力(μg /h/104 cell)=[(ΔA+0.0747)÷0.0099]÷(500×V1÷V) ÷T =2×(ΔA+0.0747) 5、按液体体积计算 单位定义：每毫升液体每小时催化产生 1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。 外切-β-1,4-葡聚糖酶活力(μg /h/mL)=[( ΔA+0.0747)÷0.0099]÷V1 ÷T =1010.1×( ΔA+0.0747) V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.1mL； T---反应时间，60min=1 小时； W---样本质量，g； 500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（2mg/mL）：从标准品管中称量取出 4mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸馏水混匀溶解即 2mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. mg/mL。也可 根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据对照管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。