滤纸酶(FPA)试剂盒

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滤纸酶(FPA)试剂盒

本试剂盒仅供科研使用 1 滤纸酶（Filter paper Activity，FPA）试剂盒说明书 （货号：WS5550F 分光法 24 样） 一、产品简介： 纤维素酶是由微生物产生的多组分的酶系，能水解纤维素β-1,4 葡萄糖苷键生成葡萄 糖，研究滤纸酶活力对纤维素酶的研究具有非常重要的意义。 滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在 540nm 处有光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计 算得滤纸酶的活力。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 滤纸条×50 根 4℃保存 试剂一 液体 40mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 液体 25mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、天平、研钵、低温离心机、恒温水 浴锅、可调式移液器。 四、滤纸酶（FPA）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 蒸馏水，进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取 ② 细菌或培养细胞 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 蒸馏 水，超声波破碎细菌或细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照数量（104）：提取液体积(mL)为 500-1000：1 的比例进行提取 ③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min， 取上清液检测。 2、上机检测： 1 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。 2 所有试剂至常温（25℃）状态。 3 每个样本需一个自身对照即煮沸样本：样本于 95-100℃水浴锅中煮沸 10min 即可。 4 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 100 100（煮沸样本） 滤纸条 1 根 1 根 试剂一 800 800 50℃孵育 60min本试剂盒仅供科研使用 2 试剂二 400 400 混匀，沸水浴（95-100℃）5min，冷却至室温 蒸馏水 400 400 混匀，取出 800μL 待检液至 1mL 玻璃比色皿中，于 540nm 处读取吸光值 A，ΔA=A 测定-A 对照（每个样 本做一个样本自身对照）。 【注】1.若 A 测定值超过 1.5，可适当对样本进行稀释再检测，或者取 200μL 至 96 孔板前 行稀释（如吸取 100μL 待检液+100μL 蒸馏水，相当于稀释 2 倍）,则相应的稀释倍数 D 需代入计算公式计算。 2. 若ΔA 差值接近零，可增加样本体积 V1（如增至 200μL，则蒸馏水相应减少，保持总 体积不变）或延长反应时间 T（如增至 2h）或增加取样质量 W，则改变后的 V1 和 T 和 W 需代入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程为：y = 5.2681x - 0.0164，x 是标准品质量（mg），y 是ΔA。 2、按照蛋白浓度计算 定义：50℃下，每毫克蛋白每小时分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。 FPA(mg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0164)÷5.2681]÷(V1×Cpr)÷T×D=1.9×(ΔA+0.0164)÷Cpr×D 3、按照样本质量计算 定义：50℃下，每克组织每小时分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。 FPA(mg/h/g)=[(ΔA+0.0164)÷5.2681]÷(W×V1÷V)÷T×D=1.9×(ΔA+0.0164)÷W×D 4、按液体体积计算 定义：50℃下，每毫升液体每小时分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。 FPA(mg/h/mL)=[(ΔA+0.0164)÷5.2681]÷V1÷T×D=1.9×(ΔA+0.0164)×D 5、按细胞数量计算 定义：50℃下，每 104个细胞每小时分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需酶量为一个酶活单位。 FPA(mg/h/104cell)=[(ΔA+0.0164)÷5.2681]÷(V1×细胞数量÷V)÷T×D =1.9×(ΔA+0.0164)÷细胞数量×D V---提取液体积，1mL； V1---反应体系中加入样本体积，0.1mL； W---样本质量，g； T---反应时间，60min=1 小时； D---稀释倍数，未稀释即为 1； Cpr---样本蛋白浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1、 制备标准品母液（5mg/mL）：向标准品 EP 管里面加入 1mL 蒸馏水（母液需在两天内用且-20℃保存）。 2、 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.6, 1.2, 1.8, 2.4, 3. mg/mL。也可根据实际样本来调整标准 品浓度。 3、100μL 标准品+800μL 试剂一+400μL 试剂二，混匀，沸水浴（95-100℃）5min，冷却至室温，再加 400μL 蒸馏水，混匀后取出 800μL 待检液至 1mL 玻璃比色皿中，于 540nm 处读取吸光值 A。根据结 果即可制作标准曲线。