β-1,3-1,4-葡聚糖酶活测定试剂盒,微板法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活测定试剂盒,微板法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活测定试剂盒,微板法

本试剂盒仅供科研使用 1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-glucanase）酶活试剂盒说明书 （货号：WS4750W 微板法 96 样） 一、产品简介： β-1,3-1,4-葡聚糖酶（又称地衣多糖酶；EC 3.2.1.73）是一类重要的水解酶，可以水解谷物 中的β-1,3-1,4-葡聚糖，其在食品、饲料和纺织等领域的具有重要应用价值。 β-1,3-1,4-葡聚糖酶水解底物葡聚糖产生还原性糖。利用 3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的 量，在 540nm 读取吸光值，进而得出β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性大小。 二、试剂盒组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 120mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉剂 mg×1 支 4℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底 部，再加 1.1mL 蒸馏水，80℃ 水浴 10min 充分溶解，冷却至 室温待用。 试剂三 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 标准品 粉体 mg×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-GA）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本： 取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）到研钵内，加入 1mL 提取液，在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 [注】：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取。 ② 细菌/真菌样本： 先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌/真菌加入 1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：也可按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。 ③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心 10min， 取上清液检测。 2、上机检测： ① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 EP 管中依次加入： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 50 50 试剂一 140 150 试剂二 10 混匀，37℃孵育 30min 试剂三 150 150本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，95℃水浴 5min，取出后用自来水或冰水冷却至室温， 取 200μL 澄清液体于 96 孔板中，在 540nm 处读取吸光值 A，ΔA=A 测定管-A 对照管（每个样本做一个对照管）。 【注】:若ΔA 在零附近徘徊，可在样本制备时加大取样质量 W（如增至 0.5g）,或在上机检测 时加大上样量 V1（由 50μL 增加到 100μL，则试剂一相应减少，保持总体积不变）， 或延长反应时间 T（如增至 60min）,则改变后的 W、V1 和 T 需带入计算公式重新计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0123x - 0.035；x 为标准品浓度（μg），y 为ΔA。 2、按蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟分解葡聚糖产生 1μg 还原性糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.035)÷0.0123]÷(V1×Cpr) ÷T =54.2×(ΔA+0.035)÷Cpr 3、按样本鲜重计算： 酶活定义：每克组织样本每分钟分解葡聚糖产生 1μg 还原性糖定义为一个酶活性单位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.035)÷0.0123]÷(W×V1÷V) ÷T =54.2×(ΔA+0.035)÷W 4、按细菌/真菌数量计算： 酶活定义：每 1 万个细菌或真菌每分钟分解葡聚糖产生 1μg 还原性糖定义一个酶活性单位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min /104 cell)=[(ΔA+0.035)÷0.0123]÷(500×V1÷V) ÷T=0.11×(ΔA+0.035) 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体中每分钟分解葡聚糖产生 1μg 还原性糖定义一个酶活性单位。 β-1,3-1,4-GA(μg/min/mL)=[(ΔA+0.035)÷0.0123]÷V1÷T=54.2×(ΔA+0.035) V---提取液体积，1mL； V1---样本上样体积，50μL =0.05mL； T---反应时间，30min； W---样本鲜重，g； 500---细菌/真菌总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品（1mg/mL）：从标准品管中称量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸馏水混匀溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. mg/mL。也可 根据实际样本来调整标准品浓度。 3 依据 50μL 标准品+150μL 试剂一+150μL 试剂三，混匀 95℃水浴 5min，取出后用自 来水或冰水冷却至室温，取 200μL 澄清液体于 96 孔板中，在 540nm 处读取吸光值 A，根据结果即可制作标准曲线。