几丁质外切酶试剂盒

几丁质外切酶试剂盒

几丁质外切酶试剂盒说明书 

（货号：WS7450F 分光法 24 样）

一、产品简介： 多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶，高等植物本身不存在作为真菌细胞壁 组分之一的几丁质，但当植物受到病原菌感染时，几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与 植物对病原微生物的抗性有关，是重要的病程相关蛋白。 几丁质酶主要水解几丁质多聚体中β-1,4-糖苷键。依据水解位置的不同可分为几丁质 内切酶和几丁质外切酶，几丁质外切酶作用于几丁质后，生成 N-乙酰氨基葡萄糖单体， 进一步与铁氰化jia反应，于 420nm 处检测，进而计算得到几丁质外切酶活性大小。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30mL×1 瓶 4℃保存 试剂一 液体 7mL×1 瓶 4℃保存 试剂二 粉体 mg×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部， 再加 2.5mL 盐酸充分混匀溶解 后，再加 2.8mL 蒸馏水混匀备用。 试剂三 液体 14mL×1 瓶 4℃保存 试剂四 粉体 g×1 瓶 4℃保存 临用前甩几下使粉体落入底部， 再加 30mL 蒸馏水溶解备用。 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、天平、水浴锅、低温离心机、盐酸。 四、几丁质外切酶活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本制备： ① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，于 4℃，12000rpm 离心 10min，取上清置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照提取液体积(mL) ：组织质量（g）为 1：5~10 的比例进行提取 ② 真菌样本：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入 1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；于 4℃， 12000rpm 离心 10min，取上清置于冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照提取液（mL）：细细胞数量（104）为 1：500~1000 的比例进行提取 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 420nm，蒸馏水调零。 ② 在 EP 管中依次加入： 试剂名称（µL） 测定管 对照管 样本 120 煮沸的样本 120 试剂一 80 80 试剂二 100 100 混匀，37℃（恒温培养箱）孵育 1.5h 后,4000rpm 离心 5min，取上清本试剂盒仅供科研使用 2 ③ 在 EP 管中依次加入： 上清液 200 200 试剂三 270 270 混匀，4000rpm 离心 5min，取上清液待测 ④ 在 EP 管中依次加入： 上清液 360 360 试剂四 480 480 混匀，95-100℃煮沸 8min，取全部液体至 1mL 比色皿中于 420nm 处 读取各管吸光值 A，ΔA＝A 对照-A 测定（每个样本做一个自身对照）。 【注】1. 煮沸的样本：于 95-100℃煮沸 10min，使样本里面的酶失去活性。 2. 若ΔA 较小，可以加大样本量（如增至 140µL，则试剂一相应减少），或增加样本取样量 （如 0.2g），则改变后的 V1 和样本 W 需代入公式重新计算。 五、结果计算： 1、 标准曲线方程：y = 0.0248x + 0.0024，X 是标准品质量（μg），y 是ΔA。 2、按照样本重量计算： 定义：每克组织每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质外切酶活性(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA-0.0024)÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×W)÷T =439.1×(ΔA-0.0024)÷W 3、按照蛋白质浓度计算： 定义：每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质外切酶活性(μg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0024) ÷0.0248×1.96]÷(V1×Cpr)÷T =439.1×(ΔA-0.0024)÷Cpr 4、按细胞数量计算： 定义：每 104个细胞每小时分解几丁质产生 1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 几丁质外切酶活性(μg/h/104 cell)=[(ΔA-0.0024) ÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×细胞数量) =439.1×(ΔA-0.0024)÷细胞数量 V---加入提取液体积，1mL； V1---样本体积，0.12mL； T---反应时间，1.5h； 1.96---体积系数； W---样本质量，g； 标准品分子量---221.21； Cpr---样本蛋白浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（1mg/mL）：标准品临用前加 2mL 蒸馏水，即为 1mg/mL。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1mg/mL。 3 依据第④步骤的加样体系：360μL 标准品+480μL 试剂六，混匀，95-100℃煮沸 10min，取全部液 体至 1mL 比色皿中于 420nm 处读取各管吸光值 A，标准品的质量作为横坐标，0 mg/mL 对应的 A 值减去各浓度标准品对应的 A 之差作为纵坐标，即可得出标准曲线。